（八)斑點ELISA
斑點ELISA（dot-ELISA)是近年新發(fā)展的一種ELISA技術(shù)，選用對蛋白質(zhì)有很強吸附能力的硝酸纖維素薄膜作固相載體，底物經(jīng)酶促反應后形成有色沉淀物使薄膜著色，然后目測或用光密度掃描儀定量。dot-ELISA可用來檢測抗體，也可用來檢測抗原，由于該法檢測抗原時操作較其他免疫學試驗簡便，故目前多用于抗原檢測。
操作方法將待檢血清作1:1～1:20稀釋，用微量加樣器將1µl血清點滴于硝酸纖維素膜（NC)上，置于70℃經(jīng)1h，將NC浸于1％BSA－PBS中，室溫搖蕩1小時，洗滌2次，加1：1000稀釋的McAb酶標記物，室溫搖蕩2小時，洗滌3次后，加底物3，3'二氨基聯(lián)苯胺或4氯－1－乙萘酚，15分鐘后，流水終止反應，以目視法判斷結(jié)果。凡顯示棕色斑點者為陽性，否則為陰性。以產(chǎn)生棕色斑點反應的最高稀釋度為抗原滴度。
該法簡易，快速，適合于現(xiàn)場應用，有廣闊的應用前景�，F(xiàn)有的資料初步證明具有診斷病人和考核治療效果，國內(nèi)已用于血吸蟲病，瘧疾，絲蟲病，棘球蚴病的診斷。國內(nèi)學者曾比較斑點ELISA和雙抗體夾心ELISA用于檢測班氏絲蟲病人循環(huán)抗原。采用相同的單克隆抗體和病人血清進行兩種方法對比試驗。結(jié)果顯示兩種方法檢測的特異性均大于95％，但是它們的敏感性有明顯不同，斑點ELISA能檢測出血清中0.055ng/ml微絲蚴抗原，而雙抗體夾心ELISA僅能測出≥10ng/ml抗原；并且前者不需要特殊的設備，適用于絲蟲病流行區(qū)。另有報告用單克隆抗體－抗原斑點試驗（McAb-AsT)檢測血清抗原診斷黑熱病，效果較為滿意，方法上進一步簡化，加樣以原濃度血清反應，效果最佳。國外還用于旋毛蟲病、絲蟲病、弓形蟲病以及肺孢子蟲病的血清學診斷方法。
�。ň�)免疫酶染色試驗
免疫酶染色試驗（immunoenzymic staining test，IEST)是以含寄生蟲病原的組織切片，印片或培養(yǎng)物涂片用作抗原進行過氧化物酶特異免疫染色后在光鏡下檢示樣本中的特異性抗體。在蠕蟲和原蟲感染中均有多種應用。
操作過程抗原組織作冰凍（5～10µm)或石蠟連續(xù)切片（4～8µm)排列于載玻片，經(jīng)丙酮固定貯存于－20℃?zhèn)溆谩Ｔx純培養(yǎng)亦可制成分隔涂片，方法均同熒光染色法抗原制片。試驗時先將抗原片在稀釋的過氧化氫溶液浸泡15分鐘，除去可能存在于組織中的內(nèi)源性過氧化物酶；抗原片用PBS沖洗后經(jīng)Tris緩沖液（PBS，pH7.6)10倍稀釋的正常兔或羊血清培育10分鐘，迅速以PBS洗滌后加檢測樣本（單個或系列稀釋度)，置濕盒室溫（20～25℃)或37℃培育30分鐘；PBS洗滌3次，每次5分鐘，然后加兔或羊抗人過氧化物酶結(jié)合物（參照ELISA法)，結(jié)合物中可加入所用抗原組織片供體動物血清約1／25～1／3體積，用以阻斷可能交叉反應，降低背景色度；抗原片以PBS洗滌3次后加聯(lián)苯胺（DAB)底物溶液（飽和聯(lián)苯胺液加等量pH7.6硼酸緩沖液，用前按9:1體積加入0.1％H2O2液)，室溫顯色10～15分鐘后在光鏡下觀察反應結(jié)果。
反應標準：“－”，組織內(nèi)抗原部位不呈現(xiàn)棕紅色；“＋”，組織內(nèi)抗原部位（如血吸蟲肝卵切片中的蟲卵)呈現(xiàn)棕紅色；“＋＋”，局部呈現(xiàn)清晰的棕紅色；“＋＋＋”，呈現(xiàn)非常清晰的棕紅色。
該法簡單，節(jié)省抗原；判斷結(jié)果不需要特殊儀器；適合于現(xiàn)場應用。IEST可用作輔助診斷病人，考核療效，血清流行病學調(diào)查及監(jiān)測疫情的方法。目前主要應用于血吸蟲病、絲蟲病及囊蟲病診斷，也可用來診斷華支囊吸蟲病、肺吸蟲病、包蟲病和弓形蟲病。
目前對該方法改進有：①用感染鼠肝組織內(nèi)蟲卵制成7µm厚度冰凍切片（或石蠟切片)作為診斷用固相抗原代替可溶性血吸蟲卵抗原作IEST，具有取材容易和應用抗原經(jīng)濟的優(yōu)點。②將冰凍切片置于載玻片上，可以反復使用載玻片，較一次性用的PVC薄膜／苯氯乙烯反應板價廉，顯著地降低了檢測費用。③判斷結(jié)果時，應用普通光鏡即可。染色標本不必即時檢查。可保存很長時間，便于復查。④陽性血清作最高滴度，可定量抗體水平，用作考核療效有及防治效果的指標。⑤IEST的反應基本原理與COPT相似，但前者應用切片蟲卵代替了COPT的整個干卵，前法的反應快速（約1.5～2小時)而后法較緩慢（需48～72小時)。為此，IEST彌補了COPT診斷時，漏檢病人和取得結(jié)果不快速的缺陷。病鼠肝組織內(nèi)蟲卵冰凍切片抗原IEST，目前已在疫區(qū)擴大應用。現(xiàn)已研制成試劑盒，批量生產(chǎn)，供應現(xiàn)場需用。
（十)免疫印漬試驗
免疫印漬試驗（immunoblot或Western blot)是由十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE)，電泳轉(zhuǎn)印及標記免疫試驗三項技術(shù)結(jié)合而成的一種新型的免疫探針技術(shù)（immuno-probing technique)，是用于分析蛋白抗原和鑒別生物學活性抗原組分的有效方法，近年已應用于檢測寄生蟲感染宿主體液內(nèi)針對某分子量抗原的相應循環(huán)抗體成分或譜型。是為一項高敏感和高特異的診斷方法，具有很大發(fā)展?jié)摿�。用于診斷的免疫印漬試驗以采用酶標記的探針（即二抗及其標記結(jié)合物)為安全方便，稱酶免疫轉(zhuǎn)移印漬試驗（enzyme immuno-transfer blotting，EITB)。
1．操作程序（以血吸蟲EITB為例)
⑴樣本分離：
1)取日本血吸蟲新鮮成蟲按5～10對／1.5ml比例加樣本緩沖液，勻漿，置沸水浴2分鐘，離心（10000g，30分鐘)，取上清液備用。
2)上述成蟲抗原樣本進行單梳SDS－PAGE電泳分離。左側(cè)梳孔加標準分子量蛋白，梳孔右側(cè)樣槽加抗原液，電壓控制在160～180V之間。
�、齐娪巨D(zhuǎn)印：
1)從電泳板中取出已完成電泳的凝膠片浸泡于盛有轉(zhuǎn)印緩沖液（TB)的搪瓷盤 內(nèi)。
2)在TB液內(nèi)組成轉(zhuǎn)印夾心板層：取相應大小的硝酸纖維（NC)薄膜，徐徐浸泡在TB液，將凝膠片與薄膜光面緊貼。兩面各放置浸濕濾紙兩層而后海綿墊（厚0.5～1cm)一層，做好方位標記，最后夾于二層有孔塑料襯板之間，絕對避免各層之間留有氣泡。醫(yī)學 全在.線提供m.52667788.cn
3)將TB倒入轉(zhuǎn)印槽中，然后插入轉(zhuǎn)印板，使凝膠片位于陰極側(cè)，NC薄膜位于陽極側(cè)。
4)置轉(zhuǎn)印槽于4℃冰箱內(nèi)，通電轉(zhuǎn)印數(shù)小時或過夜，電流控制在250mA上下（約40～50V)。
�、翘结槞z測：
1)取出轉(zhuǎn)印好的NC薄膜，水平地放入猝滅劑中，室溫搖動1小時以封閉未吸附蛋白質(zhì)的區(qū)域，然后用洗滌緩沖液選2～3次，每次30分鐘以除去亦性劑，使蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)和生物學特性得以恢復。
2)平置NC薄膜于浸有Tris-緩沖鹽水（TBS)的濾紙上，用刀片將薄膜按電泳方向分割為寬約0.5cm的直條，用鉛筆做好上端標記。
3)取其中一個細條，并同標準蛋白條帶一起作氨基黑染色（也可用考馬斯亮藍染或銀染)測試分離效果并確定分子量位置。其余細條晾干后置4℃作印漬試驗備用（抗原活性可保持3個月以上)。
�、扔n試驗：
1)置上述抗原條于分格反應板的反應槽內(nèi)，正面向上，每槽一條，預先用0.05%TBS-Tween液浸濕（TBS-T)；
2)被檢血清用TBS-T液稀釋（常用1:150)，加入反應槽中，以浸沒膜條為限。通常需0.5～1.5ml，相當于10µl血樣量（每槽加液量下同)；
3)室溫（20～25℃)振蕩60分鐘，以后用TBS-T洗6次，每次3分鐘；
4)加已稀釋的羊抗人酶結(jié)合物，溫育1.5小時，洗滌如上；
5)加入新鮮配制的底物溶液（TBS50ml+0.3%萘酚甲醇液3ml+30%H2O210µl；或二氨基聯(lián)苯胺，DAB，5mg/ml 0.05mol/L檸檬酸磷酸緩沖液，pH5.0，每60ml加3%H2O220ul和1%COCl20.2ul 和1%COC120.6ml)；
6)15分鐘后用蒸餾水沖洗數(shù)次以終止反應，薄膜條取出置玻板自然干燥；
7)陽性反應可見藍黑色（4氯1萘酚底物)或棕褐色（DAB)條帶。
2.主要試劑
�、艠颖揪彌_液：含甘油10ml，2-巰基乙醇5ml，10%SDS30ml。
⑵轉(zhuǎn)印緩沖液（TB)：Tris 3g，甘氨酸14g，甲醇250ml，水加至1000ml。
⑶Tris緩沖鹽水（TBS)：10mmol/L，Tris含0.9%NaCl，用1N HC1調(diào)pH至7.4。
⑷TBS-T液：TBS液內(nèi)含0.05%Tween-20于TBS液。
⑸猝滅劑：1%～5%BSA或0.1%～0.3%Tween-20于TBS液。
⑹氨基黑染液：0.1%W/V氨基黑（C. I. 20470)，45%V/V甲醇，10%V/V冰醋酸。
脫色液：90%V/V甲醇，2%冰醋酸。
EITB用作鑒定寄生蟲抗原的特定組分蛋白及診斷寄生蟲病的方法。在國外已成功地用于艾滋病的常規(guī)診斷，并且在瘧原蟲、弓形蟲、血吸蟲、肺吸蟲、包蟲等的研究分析方面有很多報道。國內(nèi)用于檢測包蟲病患者血清抗體也獲良好結(jié)果，初步應用于血吸蟲感染現(xiàn)場調(diào)查，用上述抗原及操作程序可檢示特異的抗腸相關(guān)31/32kD診斷蛋白抗體的條帶，呈現(xiàn)特異和敏感的特性。用本法對感染宿主不同病期抗體譜型的研究，可望獲得有效化療后早期隱退的特異條帶。批量制備抗原分離的薄膜條帶，有可能成為適用于現(xiàn)場查病的特異性診斷藥盒，不鐵為一項具有診斷潛能的新技術(shù)。
（十一)雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體
經(jīng)十多年的研究，單克隆抗體（McAb)廣泛用于寄生蟲病臨床與實驗研究。如寄生蟲蟲種與蟲株的分型和鑒定；建立以檢測循環(huán)抗原為主的免疫診斷方法；分析和純化抗原制備靶抗原；以及寄生蟲感染免疫，保護性免疫和蟲苗制備等方面，目前，國內(nèi)外有報告，McAb用于瘧疾、弓形蟲病、血吸蟲病、肺吸蟲病、棘球蚴病、絲蟲病等方面。有關(guān)McAb在瘧疾中的應用，如對蟲種，蟲株的鑒定與分型，通過采用McAb對環(huán)孢蛋白（circumsporozoite protein，CSP)抗原及裂殖體糖蛋白研究，為瘧原蟲分型鑒定提供了新的依據(jù)；單克隆抗體的應用又為提高臨床免疫診斷價值提供了極好的工具，近年來，國內(nèi)已有報告采用McAb雙夾心斑點金銀染色法和雙夾心斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗以檢測瘧原蟲循環(huán)抗原，陽性率分別達90%～93.3%和85%～86.7%，具有較高的特異性和重復性，另外發(fā)現(xiàn)某些抗子孢子、裂殖體（子)和配子體的單克隆抗體具有保護作用。保護性McAb的發(fā)現(xiàn)不僅為制備蟲苗的靶抗原提供了條件，而且為進行被動免疫開辟了途徑。
在血吸蟲病方面，單克隆抗體已應用于血吸蟲抗原分析，免疫學診斷和保護性免疫研究，國內(nèi)外均已報道采用檢測血吸蟲循環(huán)抗原，如Sj23，Sm38，Sj70等抗原，其陽性率在90%～97%，交叉反應低且有良好的療效考核價值，有關(guān)保護性免疫研究方面，主要集中在分子量分別為28kD和38kD的抗原，現(xiàn)有資料初步表明以McAb提純的28kD抗原免疫大白鼠后，可獲得70%的保護率。
在絲蟲病方面，應用雜交瘤技術(shù)已制備出識別馬來微絲蚴表面分子量分別為70kD、75kD、110kD等抗原的McAb，某些McAb能介導巨噬細胞粘附于微絲蚴表面，引起蟲體死亡。將這些McAb被動轉(zhuǎn)移給受體動物，在體內(nèi)能降低微絲蚴血癥。
�。ㄊ�)DNA探針技術(shù)
DNA技術(shù)（probe)技術(shù)，又稱核酸分子雜交（molecular hybridization)技術(shù)，最近幾年迅速發(fā)展起來的一種敏感性高，特異性強，應用面廣的研究手段。在寄生蟲病診斷中，探針是病原體的特異核酸序列，可用來檢測出病原體是否存在，其關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于獲得特異的核酸探針。近10年來應用特異的核酸探針鑒定寄生蟲和診斷寄生蟲病的研究報道較多，現(xiàn)有資料表明，DNA探針檢測，其特異性和敏感性高；并且DNA探針是直接檢測寄生蟲的基因，故比血清學方法可靠；又因探針DNA較穩(wěn)定，在合適條件下可較長期保存；在試驗條件不變時試驗結(jié)果的重演性較好。在寄生蟲病的診斷、現(xiàn)場調(diào)查、寄生蟲種的鑒定及分類等方面的研究中均已使用了DNA探針技術(shù)，內(nèi)容包括原蟲、吸蟲、線蟲、絳蟲、昆蟲的鑒定和致病的診斷。另外，核酸探針已成功地用于許多傳播媒介體內(nèi)寄生蟲的鑒定。但是一般尚在實驗階段。可望能用作高效和準確的寄生蟲病血清學方法，用以制備經(jīng)濟和理想的診斷抗原。
�。ㄊ�)PCR技術(shù)
檢測病原體遺傳物質(zhì)用以診斷寄生蟲病的方法，除分子雜交技術(shù)外，新近發(fā)展的更靈敏、快速，并且不需要同位素標記的基因擴增技術(shù)，如聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR)是一種體外擴增特異性DNA技術(shù)。
現(xiàn)已使用PCR技術(shù)于寄生蟲病診斷，如錐蟲病、利什曼病、肺孢子蟲病、腸球蟲病、賈第蟲病、弓形蟲病等，在一些疾病中，有時原蟲數(shù)量極少，用一般方法無法檢測，經(jīng)用PCR擴增DNA模板，提供了一條解決診斷的途徑。如在檢測錐蟲時，PCR擴增純化DNA可使探針檢測到血樣中1個蟲體；國內(nèi)建立了弓形蟲病PCR診斷方法，具有高度特異、敏感且快速的優(yōu)點。今后在寄生蟲學領(lǐng)域中將會更廣泛深入地開展PCR技術(shù)的應用。
