分子雜交

　　四、核酸探針的標(biāo)記和檢測(cè)（詳見每十九章　)

　　分子雜交是核酸鏈間堿基配對(duì)規(guī)則的一種結(jié)合方式，是核酸的重要理化特性。利用分子雜交這一特性來(lái)對(duì)特定核酸序列進(jìn)行檢測(cè)，必須將雜交鏈中的一條用某種可以檢測(cè)的分子進(jìn)行標(biāo)記，這條鏈就稱為核酸探針。因此，核酸探針的制備是分子雜交技術(shù)的關(guān)鍵。最早采用的也是目前最常用的核酸探針標(biāo)記方法是放射性同位素標(biāo)記。常用的放射性同位素有32P和35S前者能量高，信號(hào)強(qiáng)，最常用。放射性同位素標(biāo)記探針雖然敏感度高，但卻存在輻射危害和半衰期限制（32P半衰期為14.3天，35S半衰期為87.1天，125I的半衰期為60天)，3H的半衰期長(zhǎng)達(dá)12.3年，但它所釋放β放射線能量太低（0.018Mev)，只能用于組織原位雜交。由于同位素標(biāo)記的探針在使用過(guò)程中存在著上述缺點(diǎn)，近些年來(lái)，人們?cè)趯ふ曳呛酱�性�?biāo)記物方面取得了很大進(jìn)展，國(guó)際上已有多家公司相繼推出多種非放射性探針標(biāo)記試劑盒，在國(guó)內(nèi)也已具備生物素類標(biāo)記物的生產(chǎn)能力，并有相應(yīng)試劑出售。目前，非放射性標(biāo)記物有下述幾類：金屬如Hg，熒光物質(zhì)如FITC；半抗原如地高辛；生物素；酶類如辣根過(guò)氧化物酶（HRP)。半乳糖苷酶或堿性磷酸酶（AKP)等。不同的標(biāo)記物，所標(biāo)記探針的方法及檢測(cè)方法也各異。下面僅就國(guó)際上較常用的，有實(shí)用價(jià)值或發(fā)展前景的幾種核酸標(biāo)記方法及其顯示方法分兩方面簡(jiǎn)述如下。

　　（一)核酸探針的常用酶促標(biāo)記技術(shù)

　　1．缺口平移　該技術(shù)由Kelly等于1970年創(chuàng)立。其原理是首先用DNA酶在雙鏈DNA探針?lè)肿拥囊粭l鏈上制造一些缺口（nick ),缺口處會(huì)形成3’—羥基末端，這時(shí)再在大腸桿菌DNA聚合酶I的催化下將核苷酸殘基加在3’－羥基上，同時(shí)，根據(jù)大腸桿菌酶DNA聚合酶I的5’→3’核酸外切酶活性，此酶將缺口5’側(cè)核苷酸依次切除。其結(jié)果是在缺口平移（nick tr－anslation)。根據(jù)這個(gè)原理，如果用高強(qiáng)度的放射性核苷酸（通常為α-32PdATP)置換先前存在的核苷酸，則可制備比活性高達(dá)108cpm（每分鐘計(jì)數(shù))/μg的32P標(biāo)記DNA。用缺口平移法標(biāo)記的DNA探針能滿足大多數(shù)雜交要求。

　　2．DNA快速末端標(biāo)記　大腸桿菌DNA聚合酶i 經(jīng)枯草桿菌蛋白酶切割可得到兩條多肽鏈，其中分子量為76kd的大片段稱為Klenow片段。該酶具有完整聚合酶I的5’→3’聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性，但缺乏5’→3’核酸外切酶活性。利用Klenow片段可以填補(bǔ)由限制酶消解DNA所產(chǎn)生的3’凹陷末端。因此，用這種方法可以標(biāo)記雙鏈DNA的凹陷3’末端。用Klenow片段標(biāo)記末端一般只用一種[α-32P]dNTP，加入反應(yīng)的[α-32P]dNTP取決于DNA末端延伸的5’末端序列，例如，用Ecor I切割DNA所產(chǎn)生的末端用[α-32P]dNTP標(biāo)記。標(biāo)記反應(yīng)可在一種限制酶消解DNA后立即進(jìn)行，不需去除限制酶或使其失活，也不需更換緩沖液，具有3’延伸的DNA末端不能被Klenow片段有效在標(biāo)記，欲標(biāo)記這類分子可用T4DNA聚合酶。

　　選用這種標(biāo)記方法是為了產(chǎn)生可用于凝膠電泳時(shí)作大小參照物的DNA片段。因?yàn)闃?biāo)記的DNA片段與其摩爾濃度成比例，而不與片段大小成比例，在限制酶消化物中，小的和大的片段都以相同程度被標(biāo)記。因此，可使用放射自顯影術(shù)確定不有被溴化乙錠染色所觀察到的大小DNA帶，尤其適用于Southern吸印雜交時(shí)分子量標(biāo)志物的標(biāo)記。通過(guò)選擇相應(yīng)標(biāo)記的dNTP，該法還可以只標(biāo)記DNA分子的一端。例如，若DNA片段的兩個(gè)末端分別是Bam H I和Hind III 粘膜端，在反應(yīng)中只加入[α-32P]dNTP或[α-32P]dGTP，使可選擇性標(biāo)記兩末端之一。

　　3．用T4多核苷酸激酶標(biāo)記DNa 5’末端　寡核苷酸探針或短的RNA和DNA探針可選用此法標(biāo)記，寡核苷酸探針一般多用這種標(biāo)記。T4多核苷酸激酶（polynucleotide kinase, PNK)是由T4噬菌體感染的大腸桿菌中提取的，此酶能催化ATP的γ-磷酸轉(zhuǎn)移至DNA或RNA的5’－OH末端。在過(guò)量ADP存在時(shí)，也可促進(jìn)磷酸交換反應(yīng)，使PNK將DNA末端5’磷酸轉(zhuǎn)移到ADP上生成ATP，然后催化[α-32P]dNTP上的標(biāo)記磷酸轉(zhuǎn)移至DNA的5’末端，從而使DNA重新磷酸化，并藉此得到標(biāo)記。顯然，PNK標(biāo)記DNA末端需要[γ-32P]dNTP，這與前述酶促標(biāo)記方法不同。通常，對(duì)于5’磷酸化的DNA探針，要先用堿性磷酸酶去掉磷酸基團(tuán)，然后再用于PNK催化的5’末端標(biāo)記，這樣標(biāo)記效率較高。

　　4．隨機(jī)引物延伸　這是以單鏈DNA或RNA模板合成高比活性32P標(biāo)記探針?biāo)�選用的方法。原理是使長(zhǎng)6～8nt的寡核苷酸片段與變性的DNA或RNA模板退火，在DNA聚合酶I或反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以每一個(gè)退火到模板上的寡核苷酸片段為引物引發(fā)DNA鏈的合成，在反應(yīng)時(shí)將[α-32P]dNTP摻入合成鏈，即得到標(biāo)記。變性處理后，新合成鏈（探針片段)與模板解離，即得到無(wú)數(shù)各種大小的探針DNA。因?yàn)樗�用寡核苷酸片段很短，在低溫條件下可與模板DNA隨機(jī)發(fā)生退火反應(yīng)，因此被稱為隨機(jī)引物（random primer)。這種隨機(jī)引物可用小牛胸腺DNA或魚精DNA制備。

　　用隨機(jī)引物法標(biāo)記的DNA探針或cDNA探針比活性顯著高于缺口平移法，且結(jié)果較為穩(wěn)定。這種方法尤其適用于真核DNA探針，因?yàn)殡S機(jī)引物來(lái)自真核DNA，其與真核序列的退火率要高于原核序列。因此，對(duì)于克隆的DAN探針，常先將插入探針DNA切下來(lái)回收后再標(biāo)記，而缺口平移法可直接用于全質(zhì)粒的標(biāo)記。

　　5．聚合酶鏈反應(yīng)（詳見第二十二章)　聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR)是一種分子生物學(xué)新技術(shù)，由美國(guó)Cetus公司人類遺傳學(xué)部的Kary.B. Mullis于1985年創(chuàng)立。該技術(shù)利用兩個(gè)與相反鏈雜交并隨著于靶DNA兩側(cè)的寡核苷酸引物經(jīng)酶促合成特異的DNA片段，包括模板變性，引物退火和引物延伸三個(gè)步驟的反復(fù)循環(huán)，最終兩引物所夾靶DNA得到千萬(wàn)倍以上的擴(kuò)增。因此 ，PCR技術(shù)已成為一項(xiàng)極為有價(jià)值的技術(shù)并已迅速推廣應(yīng)用。

　　PCR技術(shù)有許多重要用途，其中之一便是可用來(lái)標(biāo)記高比活性DNA探針。PCR技術(shù)具有很高的特異性，可在1～2h之內(nèi)在量合成探針DNA片段，如果在底物中加入[α-32P]dNTP或其它標(biāo)記的dNTP，則探針DNA合成過(guò)程中可得到很好的標(biāo)記，標(biāo)記物的摻入率可高達(dá)70%～80%。因此，PCR標(biāo)記技術(shù)特別適用于大規(guī)模檢測(cè)和非放射性標(biāo)記。該法的缺點(diǎn)是要合成一對(duì)特異性PCR引物。使用從探針DNA上制備的小片段作引物也能取得較好的標(biāo)記效果。

　�。ǘ�)核酸探針的非放射性標(biāo)記技術(shù)

　　1．光敏生物素標(biāo)記核酸　目前使用的光標(biāo)生物素試劑有兩種：光生物素（乙酸鹽)和補(bǔ)骨脂素生物素。它們都是由一個(gè)光敏基團(tuán)、一個(gè)連接臂和一個(gè)生物素基團(tuán)組成。光生物素的光敏基團(tuán)是-N3，它在光作用下可與核酸中的堿基結(jié)合。補(bǔ)骨脂素生物素中的光敏基團(tuán)補(bǔ)骨脂素在光照（320～400μm)下，可與單鏈或雙鏈核酸發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)主要在T上，C上也有一定程度的反應(yīng)。光敏生物素的連接臂含6～12個(gè)碳原子，用以減少探針雜交時(shí)的空間位阻。光敏生物素標(biāo)記核酸，方法簡(jiǎn)單，靈敏度也可達(dá)到pg水平，可用于外源基因的檢測(cè)。最近出現(xiàn)了一種新的光敏活性DNA生物素試劑，即生物素-聚乙二醇-當(dāng)歸素（BPA)。BPA的DNA結(jié)合部分是一個(gè)活性糖香豆素衍生物，在長(zhǎng)波UV下它可與DNA堿基共價(jià)鍵結(jié)合。BPA反應(yīng)物與DNA結(jié)合比光敏生物素更特異，在可見光下它不與核酸反應(yīng)，這個(gè)特性可使BPA只標(biāo)記粗制細(xì)胞裂解物中的核酸，而不標(biāo)記蛋白、多糖和其他細(xì)胞大分子。

　　2．酶促生物素標(biāo)記核酸　以生物素化的脫氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP,Bio –7 – dATP、Bio-11-dCTP)等代替相應(yīng)32P標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸，經(jīng)DNA聚合酶作用摻入DNA。Bio-dUTP代替dTTP,Bio-dATP代替dATP，Bio- dCTP代替dCTP。Bio –11-dUTP的11是指生物素基團(tuán)與脫氧核苷酸之間連接臂的碳鏈長(zhǎng)度。常用的酶促生物素標(biāo)記DNA的方法有缺口平移法和隨機(jī)引物延伸法。

　　3．寡核苷酸的生物素末端標(biāo)記　有5’-磷酸的化學(xué)標(biāo)記法和3’-OH的酶促標(biāo)記法。前者將寡核苷酸的5’-磷酸接上一個(gè)乙二胺，然后用琥珀酰亞胺生物素，將生物素基團(tuán)連接在磷酸酰胺基上。后者是用末端轉(zhuǎn)移將Bio-11–dUTP加于其3’-OH端（脫去一個(gè)焦磷酸)。醫(yī)學(xué)全在線www.med126.com

　　4．酶標(biāo)DNA　標(biāo)記試劑是辣根過(guò)氧化酶（HRP)或堿性磷酸酶（AP)。通過(guò)對(duì)苯醌（PBQ)與聚乙烯亞胺（PEI)連接而成（HRP-PBQ-PEI+)，此試劑在戊二醛的作用下與變性的DNA結(jié)合，使HRP與DNA連接在一起，組成HRP標(biāo)記的DNA探針。

　　5．酶標(biāo)寡核苷酸　包括核苷酸5’末端標(biāo)記HRP法和內(nèi)部標(biāo)記AP法。前者是在HRP中產(chǎn)生一個(gè)-HS反應(yīng)基團(tuán)，在寡核苷酸合成終了加在5’端，帶一個(gè)C6的-HS基，與活化的HRP反應(yīng)生成5’-HRP寡核苷酸。后者是在全成寡核苷酸過(guò)程中將一個(gè)5’帶連接臂及CF3基團(tuán)的尿苷3’亞磷酰亞胺合成在寡核苷酸鏈中，合成后此活化的寡核苷酸與AP反應(yīng)即得到AP標(biāo)記的寡核苷酸。

　　6．DNA半抗原標(biāo)記　其原理與Bio-11-dTUP相同，只是用毛地黃甙代替生物素形成Dig –11- dUTP，酶促摻入DNA分子。用抗毛地黃甙抗體檢測(cè)標(biāo)記在DNA上的半抗原分子Digoxigenin（地高辛)

　　(三)非放射性探針的顯示體系

　　1．AP顯色體系

　　BCI –OH+NBT→紫色↓

　　ASO：等位基因特異的寡核苷酸，BCIP：5溴-4氯-3吲哚磷酸，NBT：四氮唑藍(lán)，Pi：磷酸。

　　2．HRP顯色體系

　　HRP + H2O2[HRP·H2O2]

　　ODA –NH2 +[HRP ·H2O2]棗→ODA-N = ODA/棕色↓+HRP +H2O

　　ODA：鄰-聯(lián)茴香胺。

　　3．ABC顯色體系

　　DNA –B + SA – AP→DNa – B – SA或DNa – B +SA - BAP→DNa –B –SA –BAP

　　經(jīng)上述兩反應(yīng)，把AP連接在DNA上以后，再進(jìn)行AP酶顯色。這里SA為Streptavidin（鏈酶親合素)，BAP為生物素化的磷酸酶，B為生物素（biotin)，ABC為Avidin – Biotin - Enzyme com－plex, 即親合素- 生物素-酶復(fù)合物。

　　以上反應(yīng)AP亦可用HRP代替。

表18-3曱核酸探針的標(biāo)記分子

　　* ：NT：缺口平移； PCR：聚合酶鏈反應(yīng)；RPL： 隨機(jī)引物標(biāo)記； TL：末端標(biāo)記

　　4．非放射發(fā)光自顯影　　若將AP或HRP的顯色底物根據(jù)光化學(xué)原理?yè)Q成一種酶解后產(chǎn)生光子的化合物，可用自顯影技術(shù)暴光X線片顯示。

　　（1)HRP發(fā)光自顯影：氨基苯-甲酰肼在HRP與H2O2的作用下氧化為氨基苯二甲酸，同時(shí)放出N2及發(fā)光（波長(zhǎng)428nm)。發(fā)光時(shí)加入某些酚的衍生物時(shí)可增強(qiáng)發(fā)光上千倍。反應(yīng)如下圖：

　�。�2)AP的發(fā)光自顯影：AP的發(fā)光底物是金剛烷二氧丁環(huán)磷酸鹽（AMPPD)，它含有磷酸酯鍵在AP的作用下水解下一個(gè)磷酸，進(jìn)而由分子內(nèi)過(guò)氧鍵提供能源分解產(chǎn)生金剛酮和激發(fā)態(tài)的甲基間-氧苯甲酸陰離子，當(dāng)此陰離子恢復(fù)到基態(tài)時(shí)發(fā)出光子�？捎貌ɡ�黑白片（621型)直接暴光顯影。顯影信號(hào)強(qiáng)度比BCIP/NBP顯色法強(qiáng)兩上數(shù)量級(jí)。是很前景的顯示體系。

　　其發(fā)光反應(yīng)的原理如下：

　　HRP的發(fā)光原理：

　　AP的發(fā)光原理：

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