由于脈管系統(tǒng)內(nèi)寄生蟲的寄生部位及離體途徑的不同，決定了病原學(xué)檢查方法的不同。弓形蟲滋養(yǎng)體速殖子階段也可寄生在血液的有核細(xì)胞內(nèi)。本章主要介紹絲蟲、血吸蟲、瘧原蟲、利什曼原蟲、錐蟲及巴貝蟲的病原學(xué)檢查。有關(guān)免疫學(xué)及分子生物學(xué)檢查方法見其它網(wǎng)頁。
一、血膜染色法
血液檢查是診斷瘧疾、絲蟲病、巴貝蟲病和錐蟲病的基本方法。從指尖或耳垂取血，嬰兒可于足部取血。先用75％酒精棉球擦拭取血部位， 待干后持采血針迅速刺入皮膚1～2 mm 深， 擠出血滴涂片。間日瘧宜在發(fā)作后數(shù)小時(shí)采血；惡性瘧在發(fā)作初期采血可見大量環(huán)狀體，1 周后可見配子體。絲蟲成蟲寄生于淋巴系統(tǒng)，但產(chǎn)出的微絲蚴主要在血循環(huán)中，且具有夜現(xiàn)周期性，故采血應(yīng)在晚9 時(shí)至次晨2時(shí)之間進(jìn)行為宜。
1．血膜制片
瘧原蟲檢查多用薄血膜或厚血膜法，前者取血量少，涂面大，瘧原蟲分散，但蟲體形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，易于作蟲種鑒別；后者取血量較多，紅細(xì)胞較集中，在瘧原蟲數(shù)量較少時(shí)便于發(fā)現(xiàn)，但因制片時(shí)血細(xì)胞相互堆積擠壓，瘧原蟲皺縮變形， 缺乏經(jīng)驗(yàn)者較難辨認(rèn)。故最好在同一張載玻片上同時(shí)做厚、薄血膜（如下圖)，以便比較觀察。
血液涂片的制作
（1) 薄血膜制片：在載玻片1／3 與醫(yī)師招聘2／3 交界處蘸血一小滴（約2μl)，以一端緣光滑的載片為推片，將推片一端置于血滴之前，并與載片形成30～45 度的夾角， 待血液沿推片端緣擴(kuò)散時(shí)，均勻而迅速適當(dāng)?shù)赜昧ο蚯巴瞥杀⊙�。血量不宜太多或太少，兩玻片間的夾角要適當(dāng)，否則血膜會(huì)過厚或過薄。推片時(shí)用力要均勻，一次推成，切勿中途停頓或重復(fù)推片。理想的薄血膜，應(yīng)是血細(xì)胞分布均勻，無裂縫，整個(gè)血膜呈舌形。
（2) 厚血膜制片：于載玻片的另一端1／3 處蘸血一滴（約3μl)，以推片的一角，將血滴自內(nèi)向外作螺旋形攤開，使之成為直徑約1cm 的厚血膜。厚血膜為多層血細(xì)胞的重疊，約等于20 倍薄血膜的厚度。過厚則血膜易脫落， 過薄則達(dá)不到濃集蟲體的目的。將厚、薄兩種血膜涂在同一張載玻片上，方法是將載玻片分成六等份，將厚血膜涂在第三格的中央，薄血膜涂在第四格前緣至第六格中部，一、二格備貼標(biāo)簽及編號(hào)用。厚、薄血膜需用蠟筆劃線分開，以免厚血膜溶血時(shí)影響薄血膜或薄血膜用甲醇固定時(shí)影響厚血膜。檢查微絲蚴時(shí)，需取血3 大滴，（相當(dāng)于60 mm3)，涂成直徑約1．5～2．0cm 的圓形或2．5cm×1．5cm 長(zhǎng)方形厚血膜。血片充分晾干，用甲醇或無水酒精固定薄血膜。如薄、厚血膜在同一玻片上，切勿將固定液流到厚血膜上。厚血膜上滴加蒸溜水進(jìn)行溶血，待血膜呈灰白色時(shí)， 將水倒去，晾干后再用甲醇固定。
2．染色
（1) 姬氏染色法（Giemsa stain)： 此法染色效果良好，血膜褪色較慢，保存時(shí)間較久，染色技術(shù)也易掌握，適用于染大批量血片標(biāo)本。①染液配制：姬氏染劑粉1g，甲醇50 ml，純甘油50 ml 。將姬氏染劑粉置于研缽中，加小量甘油充分研磨，加甘油再磨， 直至50 ml 甘油加完為止，倒入棕色瓶中。然后分幾次用少量甲醇沖洗缽中甘油染粉，倒入玻瓶直至50 ml 甲醇用完為止， 塞緊瓶口，充分搖勻，置65℃溫箱內(nèi)24 小時(shí)或室溫陰暗處1～2 周后過濾，備用。②染色方法：用pH6．8～7．0 的緩沖液，將姬氏染液稀釋，比例約為15～20 份緩沖液加一份姬氏染液。用蠟筆劃出染色范圍，將稀釋的姬氏染液滴于已固定的薄、厚血膜上，染色半小時(shí)（室溫)，再用上述緩沖液沖洗。血片晾干后鏡檢。
（2) 快速姬氏染色法：姬氏染液1 ml，加緩沖液5 ml，如前法染色5 分鐘后用緩沖
液沖洗，晾干后鏡檢。
（3) 瑞氏染色法（W right’s stain)：此法操作簡(jiǎn)便，適用于臨床診斷，但甲醇蒸發(fā)甚快，掌握不當(dāng)易在血片上發(fā)生染液沉淀，并較易褪色，保存時(shí)間不長(zhǎng)，多用于臨時(shí)性檢驗(yàn)。
①染液配制：瑞氏染劑粉0．1～0．5g，甲醇97 ml，甘油3 ml 。將瑞氏染劑粉加入甘油中充分研磨，然后加少量甲醇，研磨后倒入瓶?jī)?nèi)，再分幾次用甲醇沖洗缽中的甘油溶液，倒入瓶?jī)?nèi)直至用完為止。搖勻，
24 小時(shí)后過濾待用。②染色方法：瑞氏染劑含甲醇，薄血膜不需先固定；厚血膜則需先經(jīng)溶血，待血膜干后才能染色。染色前先將溶過血的厚血膜和薄血膜一起用蠟筆劃好染色范圍，以防滴加染液時(shí)外溢。滴染液使覆蓋全部厚、薄血膜，30 秒至1 分鐘后加等量蒸餾水， 輕輕搖動(dòng)載玻片，使蒸餾水和染液混合均勻，此時(shí)出現(xiàn)一層燦銅色浮膜， 約3～5 分鐘后用水緩慢從玻片一端沖洗（注意勿先倒去染液或直對(duì)血膜沖洗)，至血膜呈現(xiàn)紫灰色為止，晾干后鏡檢。
在鏡檢薄血膜過程中，有時(shí)遇見與醫(yī)師招聘網(wǎng)瘧原蟲類似的物體，應(yīng)加以區(qū)別。如單個(gè)血小板附著于紅細(xì)胞上，易誤認(rèn)為環(huán)狀體或發(fā)育中的滋養(yǎng)體。成堆的血小板易誤認(rèn)為成熟裂殖體。血小板中央部常呈紫紅色顆粒狀結(jié)構(gòu)，周邊部分著色淺，但不如瘧原蟲紫紅色的胞核與淺藍(lán)色的胞質(zhì)分得清楚。此外還有染液沉淀顆粒以及偶有細(xì)菌、霉菌、塵粒、白細(xì)胞碎片重迭于紅細(xì)胞上，很象環(huán)狀體或滋養(yǎng)體。但這些類似物大多呈一種顏色，如細(xì)調(diào)顯微鏡焦距，可以看出它們與紅細(xì)胞不在同一水平面上。特別注意瘧原蟲與巴貝蟲的鑒別。厚血膜經(jīng)溶血后，紅細(xì)胞輪廓已消失，瘧原蟲皺縮變形， 蟲體比薄血膜中的略�。挥械寞懺x胞質(zhì)著色很深，胞核模糊不清，初學(xué)者較難識(shí)別。檢驗(yàn)人員必須經(jīng)過一段時(shí)間的嚴(yán)格訓(xùn)練，在充分掌握薄血膜中各種瘧原蟲的形態(tài)特征后，才能認(rèn)清厚血膜中的瘧原蟲。當(dāng)厚、薄血膜涂在同一片上時(shí)，應(yīng)先檢查厚血膜，發(fā)現(xiàn)瘧原蟲后如鑒定蟲種有困難，可再仔細(xì)觀察薄血膜，以節(jié)約時(shí)間，提高鏡檢率。在低倍鏡下，微絲蚴為細(xì)長(zhǎng)、無色透明、頭端鈍圓、尾端尖細(xì)、呈不同彎曲的蟲體。注意在血膜上有時(shí)留有棉纖維，狀似微絲蚴，應(yīng)加以鑒別。棉纖維的長(zhǎng)短粗細(xì)不等，兩端多呈折斷狀，內(nèi)部常見縱行條紋。血膜染色法是診斷絲蟲病最常用的方法，不僅可以避免漏檢，還可鑒別蟲種和定量計(jì)數(shù)微絲蚴。另外也可用離心濃集法以提高檢出率，常用于門診，但操作復(fù)雜，且需靜脈采血，不宜用于普查。海群生白天誘出法可用于夜間取血不方便時(shí)，但對(duì)低密度感染患者易漏診。
二、溶血離心沉淀法
溶血離心沉淀法又稱濃集濕血片染色法，不需特殊儀器設(shè)備，是基層醫(yī)院快速、準(zhǔn)確地診斷瘧疾的良好方法。將離心管內(nèi)加入2／10000 的白皂素蒸餾水溶液1 ml， 取受檢者耳垂血一大滴入該試管內(nèi)，混勻后常規(guī)離心5 分鐘，吸去上清液，底部沉渣搖勻。取一滴于干凈載玻片上，再用直徑為1．5～2．0 mm 的鐵絲棒依次蘸取0．4％ 的伊紅液和吉氏原液，先后于該載玻片上液體混勻， 然后覆以22 mm×22 mm 蓋片，即可在油鏡下檢查，鏡檢10 分鐘查不見瘧原蟲者為陰性。經(jīng)該法處理后的標(biāo)本，白皂素液破壞了大部分正常的紅細(xì)胞，少量未被破壞的紅細(xì)胞邊緣紫色呈鋸齒狀。感染瘧原蟲的紅細(xì)胞對(duì)染料的吸附力較正常紅細(xì)胞為強(qiáng)，除少數(shù)感染小滋養(yǎng)體期的紅細(xì)胞發(fā)生變形外，其它含各期瘧原蟲的紅細(xì)胞皆不變形，且著色較深，瘧原蟲胞漿染為深蘭色，核為紫紅色，瘧色素為褐色，在鏡下較易識(shí)別。由于白皂素破壞了正常的紅細(xì)胞，離心又使瘧原蟲濃集于試管底部，使單位面積內(nèi)含蟲數(shù)量增多，從而提高了檢出率。但在操作時(shí)，試管內(nèi)白皂素與血液混合后放置時(shí)間及離心時(shí)間都不宜過長(zhǎng)，否則會(huì)出現(xiàn)絮狀物，影響檢查結(jié)果。
三、尼龍絹篩集卵法
此法是診斷慢性血吸蟲病的首選方法，可顯著提高檢出率。取30～50g 糞便，置于杯內(nèi)，用少量水將糞便攪勻，經(jīng)粗篩過濾后的糞液， 用兩個(gè)重疊的尼龍篩（120 目在上，200 目在下) 收集，用一定壓力的自來水邊洗邊篩，直至流水變清為止，繼而將留有糞液的200 目尼龍篩浸泡在20％NaO H 溶液中消化10 分鐘，自來水沖洗去掉細(xì)渣，吸取篩內(nèi)糞渣鏡檢蟲卵。應(yīng)特別注意的是尼龍篩在使用前后均應(yīng)經(jīng)來蘇液浸泡，自來水沖洗干凈，避免蟲卵嵌在篩孔中造成交叉污染。此外，篩孔的孔徑若被破壞可顯著影響檢出率。
四、毛蚴孵化法
毛蚴孵化法（
miracidiu m hatchingmethod) 是依據(jù)血吸蟲卵內(nèi)毛蚴在適宜溫度的水中，短時(shí)間內(nèi)可孵出的特性而設(shè)計(jì)，適用于早期血吸蟲病患者的糞便檢查。其特點(diǎn)是將沉淀法和孵化法結(jié)合進(jìn)行，可提高檢出率。取糞便約30g， 先經(jīng)重力沉淀法處理，將糞便沉渣倒入三角燒瓶?jī)?nèi)，加清水（涼開水) 至瓶口，在20℃～30℃的條件下， 經(jīng)4～6 小時(shí)后用肉眼或放大鏡觀察結(jié)果。可見水面下呈白色點(diǎn)狀物作直線游動(dòng)的毛蚴。必要時(shí)可用吸管吸出白色點(diǎn)狀物鏡檢。如無毛蚴，每隔4～6 小時(shí)（24 小時(shí)內(nèi)) 觀察一次。氣溫高時(shí)，毛蚴在短時(shí)間內(nèi)孵出，故在夏季要用1．2％食鹽水或冰水沖洗糞便， 最后一次改用室溫清水。
五、直腸活組織檢查法
慢性及晚期血吸蟲病人腸壁組織增厚，蟲卵排出受阻，故糞便中不易查獲蟲卵，可做直腸活組織檢查。用直腸鏡鉗取直腸粘膜組織，做切片或置于兩塊載玻片間壓薄，鏡檢蟲卵�？勺屑�(xì)區(qū)分活卵、變性卵和死卵�；盥褭E圓形，淡黃色，卵殼薄而邊緣整齊，內(nèi)含毛蚴或卵黃細(xì)胞及胚細(xì)胞；死卵呈黑灰色，卵殼增厚和邊緣不清，卵內(nèi)毛蚴成團(tuán)塊狀，卵黃細(xì)胞和胚細(xì)胞分解成大量的碎片或顆粒；蟲卵死亡后形態(tài)變化不明顯的稱為近期變性卵，形態(tài)變化明顯的稱為遠(yuǎn)期變性卵。對(duì)未治療病人檢出的蟲卵，不論死活均有參考價(jià)值；對(duì)有治療史的病人，如有活卵或近期變性卵，表明受檢者體內(nèi)有成蟲寄生；若為遠(yuǎn)期變性卵或死卵，則提示受檢者曾經(jīng)有過血吸蟲感染。目前流行區(qū)血吸蟲病人大多經(jīng)過一次或多次治療，檢查到活卵的病例較少，并且此方法有一定的創(chuàng)傷性，故應(yīng)慎用。
六、穿刺涂片染色法
主要用于檢查利什曼原蟲無鞭毛體，也可查到錐蟲。
1．骨髓穿刺
一般常作髂骨穿刺，囑患者側(cè)臥， 暴露髂骨部位。視年齡大小， 選用17～20 號(hào)帶有針芯的干燥無菌穿刺針，從骸骨前上棘后約1cm 處刺入皮下，當(dāng)針尖觸及骨面時(shí)，再慢慢地鉆入骨內(nèi)約0．5～1．0cm，即可拔出針芯，接2 ml 干燥注射器，抽取骨髓液。取少許骨髓液作涂片甲醇固定，同薄血膜染色法染色，油鏡檢查。
2．淋巴結(jié)穿刺檢出率低于骨髓穿刺，但方法簡(jiǎn)便、安全。對(duì)于以往治療的患者，因其淋巴結(jié)內(nèi)原蟲消失較慢，故仍有一定診斷價(jià)值。穿刺部位一般選腹股溝部，先將局部皮膚消毒，用左手拇指和食指捏住一個(gè)較大的淋巴結(jié)，右手用一干燥無菌6 號(hào)針頭刺入淋巴結(jié)。稍待片刻，拔出針頭，將針頭內(nèi)淋巴結(jié)組織液滴于載玻片上，做涂片染色檢查。
3．皮膚活組織檢查利什曼原蟲在皮膚上出現(xiàn)丘疹和結(jié)節(jié)等疑似皮膚型黑熱病患者，可選擇皮損較明顯之處，作局部消毒，用干燥滅菌的注射器，刺破皮損處，抽取組織液做涂片；或用消毒的鋒利小剪，從皮損表面剪取一小片皮膚組織，以切面做涂片；也可用無菌解剖刀切一小口，刮取皮膚組織做涂片。以上涂片均用瑞氏或姬氏染液染色。如涂片未見原蟲，可割取小丘疹或結(jié)節(jié)，作組織切片染色檢查。
七、原蟲培養(yǎng)法
1．前鞭毛體培養(yǎng)
常用3N 培養(yǎng)基（N0vy－MacNeal－Nicolle cultue medium)。
（1)培養(yǎng)基制備：1．4g 瓊脂、0．6g 氯化鈉加入90 ml 雙蒸水，加熱溶解后每3～5 ml分裝入培養(yǎng)管中，用棉塞塞緊管口，121℃15 min 滅菌， 待冷卻至48℃時(shí)每管加入培養(yǎng)基1／3 量的去纖維素蛋白的兔血清，混勻后斜置冷卻成斜面。每管加入洛克液0．2～0．3 ml，置37℃溫箱中培育24 小時(shí)，證明無菌后即可應(yīng)用，接種前加青霉素和鏈霉素。
（2)操作步驟：取皮膚或組織、骨髓標(biāo)本加入培養(yǎng)管中，22℃～25℃ 溫箱中培養(yǎng)。每2～3 天取少量培養(yǎng)液鏡檢或染色鏡檢， 一旦發(fā)現(xiàn)有前鞭毛體則應(yīng)立即取數(shù)滴培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基。若為陰性，應(yīng)轉(zhuǎn)種培養(yǎng)1 個(gè)月再報(bào)告結(jié)果。
2．無鞭毛體培養(yǎng)
利什曼原蟲的無鞭毛體寄生在哺乳動(dòng)物的單核吞噬細(xì)胞內(nèi)，也可以體外培養(yǎng)在這類細(xì)胞內(nèi)，例如可在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)株J774 G8 內(nèi)培養(yǎng)或在直接從外周血分離的單核細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)。前者巨噬細(xì)胞分裂，且蟲體大量增殖，但有時(shí)會(huì)混有前鞭毛體。后者則適用于短期實(shí)驗(yàn)，雖然蟲體自身增殖，但巨噬細(xì)胞并不分裂。無鞭毛體還可以生長(zhǎng)在無細(xì)胞的培養(yǎng)基中。這種無鞭毛體可以被巨噬細(xì)胞迅速吞噬，并在細(xì)胞內(nèi)分裂，可轉(zhuǎn)化為前鞭毛體。一般培養(yǎng)溫度為
33℃，每96 小時(shí)轉(zhuǎn)種一次。
3．瘧原蟲培養(yǎng)
四種人體瘧原蟲的紅內(nèi)期， 僅惡性瘧原蟲可以成功地在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)。但操作復(fù)雜，需要人的“O” 型血紅細(xì)胞、人血清及由3％氧氣、4％二氧化碳和93％氮?dú)饨M成的氣體充在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。當(dāng)然還需要基本的培養(yǎng)液例如RPMI1640 等。
八、動(dòng)物接種法
1．利什曼原蟲
取可疑利什曼患者骨髓或淋巴結(jié)穿刺液或皮膚刮取物，加適量生理鹽水稀釋后，取0．5 ml 注入中華倉鼠等動(dòng)物腹腔內(nèi)，3～4 周后解剖動(dòng)物，取肝、脾、淋巴結(jié)或骨髓作涂片，經(jīng)吉氏或瑞氏液染色后，鏡檢見到無鞭毛體即可確診。
2．瘧原蟲
感染人體瘧原蟲的動(dòng)物模型均為靈長(zhǎng)類動(dòng)物，為瘧疾的研究提供了有利的條件。用于瘧疾診斷，其價(jià)格昂貴，且周期長(zhǎng)。
九、體液內(nèi)微絲蚴檢查法
對(duì)慢性或晚期絲蟲病人，可取鞘膜積液、乳糜尿、乳糜腹水等體液離心涂片或染色查微絲蚴，但檢出率常較低。含乳糜的液體可加乙醚使脂肪充分溶解，去除上面的脂肪層，加水稀釋10 倍后，以1500～2000rp m／min 離心3～5 分鐘，取沉渣涂片直接鏡檢活微絲蚴或染色鏡檢。如液體中因蛋白含量高而呈膠狀，可先加抗凝劑， 然后用水稀釋10 倍，按上述條件離心沉淀鏡檢。
