衛(wèi)生毒理學(xué)-實(shí)驗(yàn)指導(dǎo):實(shí)驗(yàn)一 經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)

 化學(xué)毒物經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)是研究化學(xué)物毒性效應(yīng)的基本試驗(yàn)。奉實(shí)習(xí)的目的是學(xué)習(xí)急性毒性試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，學(xué)會(huì)經(jīng)口灌胃技術(shù)、隨機(jī)分組方法，掌握主要的LD50計(jì)算方法和急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)。

 選擇健康的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，根據(jù)體重按隨機(jī)分組的方法，依據(jù)LD50計(jì)算的設(shè)計(jì)原則將動(dòng)物分成數(shù)個(gè)染毒組。一次或24h內(nèi)多次給予受試物后，了解動(dòng)物所產(chǎn)生的急性毒性反應(yīng)及其嚴(yán)重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因，觀察受試物毒性反應(yīng)與劑量的關(guān)系，求出半數(shù)致死劑量(LD50)，并根據(jù)LD50值將受試物進(jìn)行急性毒性分級。

1．健康小鼠或大鼠的選擇，性別的辨認(rèn)。

2．稱重、編號和隨機(jī)分組方法。

3．受試化學(xué)物溶液的配制。

4．小鼠和大鼠經(jīng)口灌胃操作技術(shù)．

5．毒性體征的觀察、LD50計(jì)算和毒性分級

 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物  健康成年小鼠或大鼠若干只。

 2.器材  灌胃針(大鼠、小鼠適用)、注射器(0.25，1.2，5m1)、吸管(0.1，0.2，0.5，1，2，10ml)、容量瓶(10，25，50ml)、燒杯(10，25，50ml)、滴管、電子天平(感應(yīng)量1／10000g)、動(dòng)物體重秤、外科剪刀、鑷子。

 3.試劑  受試物(由指導(dǎo)教師自定)，苦味醒酒精飽和液，o．5％品紅溶液或其他染色劑．

1．健康動(dòng)物的選擇。

2．性別辨認(rèn)。

3.動(dòng)物稱重、編號和分組；

  (1)稱重；稱量大、小鼠體重的秤，其感應(yīng)量需在0.1g以下，并經(jīng)過校正。稱量時(shí)注意輕抓輕放動(dòng)物，避免激惹，等動(dòng)物安靜后記錄體重讀數(shù)，以g表示。

  (m.52667788.cn/wsj/2)編號：以染色法編號。用苦味醒酒精飽和液為染料。以黃色為個(gè)位數(shù)號碼，紅色為十位數(shù)號碼。一股以頭部為1號，按順時(shí)針依次右前肢為2號，右腰為2號，右后肢為4號，尾根部為5號，右后肢為s號，左腰為7號，左前肢為8號，后背為9號，10號為在頭部染紅色標(biāo)記，11號在右前肢染紅色和黃色標(biāo)記各一，依次類推。

  (3)隨機(jī)分組。

  4．劑量設(shè)置  由指導(dǎo)教師根據(jù)受試物類別，選擇LD50計(jì)算方法設(shè)計(jì)劑量組。

  5．受試物的配制

  (1)量取受試物：固體化學(xué)物采用稱量法，液體化學(xué)物可用稱量法或吸量法

  1)稱量法：將受試物放入已知重量的容器內(nèi)稱重。加溶劑溶解或稀釋，傾入刻度容器（如容量瓶)內(nèi)，混勻，再加溶劑至刻度。算出濃度(rog／mi)備用。

  2)吸量法：依設(shè)計(jì)劑量計(jì)算出應(yīng)吸取液態(tài)受試物的容積，加入容量瓶中，用溶劑加至

刻度。計(jì)算公式為：

X＝A*V/d*1000

式中；x：應(yīng)吸取受試物的容積(mD；

A：設(shè)計(jì)要求的受試物濃度(mg／ml：

V：容量瓶容積(m1)；

d；受試化學(xué)物比重。

(2)受試物的稀釋

  1)等濃度稀釋法：將受試化學(xué)物配成一種濃度，此時(shí)各劑量組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物將給予不同體積的受試物。例如受試物配成1000mg／lOml的溶液，五個(gè)劑量組的劑量分別為100、200、400、800、1600mg／kg，則各劑量組動(dòng)物將依次給予1.0mi／kg、2．Omi／kg直至最高劑量組的16mi／kg。

  2)等容量稀釋法：按照事先設(shè)計(jì)的劑量分別稀釋配制為幾種不同濃度的受試物溶液，各個(gè)劑量組的動(dòng)物均給予相同單位體重體積的受試化學(xué)物。如上例的情況，將受試物別配成l00mg／10ml、200mg／l0ml、400mg／10ml、800mg／10ml、1600mg／10ml 5個(gè)濃度，溶液，各劑量組動(dòng)物給予受試物的體積均為l0ml／kg。

  6、灌胃操作  小鼠、大鼠及豚鼠灌冒法：采用專用小鼠和大鼠灌胃針，也可自制。將頭的16號注射針(適用于小鼠)或20~24號腰穿針(適用于大鼠、豚鼠)(注意事先可用錫在針尖周圍焊一圓頭，使其不易損傷動(dòng)物的消化遭)安裝在適當(dāng)容積的注射器上，吸所需的受試物溶液，左手抓住動(dòng)物雙耳后至背部的皮膚(小鼠僅抓住耳后、頸部的皮膚，無名指、小手指和大魚際肌將其尾根部壓緊)，將動(dòng)物固定成垂直體位，腹部面向操作。注意使動(dòng)物的上消化道固定成一直線。右手持注射器，將針頭由動(dòng)物口腔側(cè)插入，避牙齒，沿咽后壁緩緩滑人食管。若遇阻力，可輕輕上下滑動(dòng)探索，一旦感覺阻力消失，即深人至胃部。如遇動(dòng)物掙扎，應(yīng)停止進(jìn)針或?qū)⑨槹纬�，千萬不能強(qiáng)行插入，以免穿破食，甚至誤入氣管，導(dǎo)致動(dòng)物立即死亡。

 一般進(jìn)針深度小鼠2.5～4cm，大鼠或豚鼠4～6cm。為了驗(yàn)明是否已正確地插入胃部，可輕輕回抽注射器，如無氣泡抽出，表明已插入胃中；如有大量氣泡，則提示誤插氣管，應(yīng)抽出重插。隨后將受試物溶液注入。灌胃容量小鼠通常為o．2～1ml，大鼠1～4ml，豚鼠l～5ml。

7．中毒體征和動(dòng)物死亡情況觀察  染毒后注意觀察毒性體征和死亡情況。高劑量組動(dòng)物的死亡常很快發(fā)生，染毒后應(yīng)即刻密切觀察。觀察和記錄中毒體征及出現(xiàn)的時(shí)間、死亡數(shù)量和時(shí)間及死亡前的特征。根據(jù)觀察情況分析中毒特點(diǎn)和毒作用靶器官．

LD₅₀計(jì)算：根據(jù)受試物的種類由指導(dǎo)教師事先確定采用何種方法(改進(jìn)寇氏法、霍恩法等)進(jìn)行計(jì)算，并在試驗(yàn)前設(shè)計(jì)劑量分組和每組動(dòng)物數(shù)。選擇適宜的方法求出LD₅₀及95％的可信限范圍．如毒性反應(yīng)存在性別差異，應(yīng)分別求出不同性別動(dòng)物的LD₅₀值。

 根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中毒體征、死亡時(shí)間和特征、LD₅₀，按受試物種類急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評定，判斷該受試物的毒性大小及毒性特征。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容；

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬、晶系、性別及來源。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食和健康狀況。

2．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重和隨機(jī)分組情況．

3．受試物的名稱、來源、純度、性狀等情況。

4．受試物的配制和溶媒。

5．詳細(xì)描述實(shí)驗(yàn)觀察的中毒表現(xiàn)和死亡情況等。

6．LD₅₀的計(jì)算方法和結(jié)果。