實驗十四 白喉棒狀桿菌
白喉棒狀桿菌(白喉桿菌，C. diphtheriae)為革蘭陽性桿菌，菌體細(xì)長，粗細(xì)不均，一端或兩端膨大呈棒狀，菌體內(nèi)有異染顆粒，排列不規(guī)則，常呈V、L形或堆積如柵欄狀。白喉桿菌無芽胞、莢膜與鞭毛，異染顆粒和特殊的排列是其主要形態(tài)特征。
白喉桿菌需氧或兼性厭氧，在普通培養(yǎng)基中生長緩慢，在呂氏凝固血清培養(yǎng)基上生長迅速且菌體的異染顆粒明顯；亞碲酸鉀血平板是白喉桿菌的選擇鑒定培養(yǎng)基，常用于白喉桿菌的生物分型。
白喉桿菌能產(chǎn)生白喉外毒素，致白喉。
（一)形態(tài)與培養(yǎng)特性
【材料與方法】
1．油鏡下觀察白喉桿菌革蘭染色示教片及奈瑟(Neisser)染色示教片。
2．觀察白喉桿菌在呂氏凝固m.52667788.cn血清斜面、血平板及亞碲酸鉀血平板上的培養(yǎng)特性。
【結(jié)果】
1．革蘭染色片中的白喉桿菌為紫色細(xì)長桿菌，著色深淺不均，排列不規(guī)則；奈瑟染色片中的白喉桿菌為淡黃色細(xì)長桿菌，菌體內(nèi)有深藍紫色異染顆粒，排列不規(guī)則。
2．白喉桿菌在呂氏凝固血清斜面上形成灰白色的菌苔；血平板上的白喉桿菌菌落呈圓形，直徑約1mm，灰白色，不透明，光滑，邊緣整齊，輕型菌株的菌落周圍有狹窄的溶血環(huán)；亞碲酸鉀血平板上的白喉桿菌的不同型別的菌落可呈灰黑色、灰色或黑色，其他特性與血平板上的菌落相同。
（二)阿伯特(A1bert)染色法
阿伯特染色法是白喉桿菌常用的染色法之一，常用于白喉桿菌的分離鑒定。
【材料】
1．白喉桿菌呂氏凝固血清斜面12～18培養(yǎng)物。
2．阿伯特染液等。
【方法】
1．自斜面取白喉桿菌作涂片、干燥及固定。
2．染色：滴加阿伯特染液甲液，染色5min后水洗，再用乙液染色1min，水洗，干后鏡檢。
【結(jié)果】
鏡檢：白喉桿菌細(xì)長，排列不規(guī)則，菌體呈藍綠色，異染顆粒為藍黑色。
（三)毒力試驗(Elek平板法)
白喉桿菌的有毒菌株可產(chǎn)生白喉外毒素，白喉抗毒素可與其特異性結(jié)合，中和白喉外毒素的毒性，可用細(xì)菌培養(yǎng)法和動物試驗予以證實。
【原理】
Elek平板毒力試驗是一種體外的毒力測定方法。通過觀察白喉抗毒素與白喉外毒素的雙向瓊脂擴散現(xiàn)象，判斷所培養(yǎng)的白喉桿菌的產(chǎn)毒性。
【材料】
1．產(chǎn)毒素的白喉桿菌、類白喉桿菌及待測的白喉桿菌呂氏血清斜面24h培養(yǎng)物。
2．Elek瓊脂蛋白胨培養(yǎng)基。
3．白喉抗毒素(1000u/m1)、馬或兔血清(無菌)、無菌濾紙條(6.0×1.5cm)、無菌5ml刻度吸管、無菌平皿及鑷子等。
【方法】
1．將Elek瓊脂蛋白胨培養(yǎng)基10ml加熱融化，待冷至50～55℃時，加入無菌的馬或兔血清2ml，立刻混勻，并傾注平板。
2．趁瓊脂未凝固前，用無菌鑷子將浸有白喉抗毒素(1000u/m1)的濾紙條(盡量使濾紙條上的抗毒素流盡)貼于平板中央，待瓊脂凝固后將平板置37℃溫箱內(nèi)1～2h(平板面朝下)，使培養(yǎng)基略干燥。
3．如圖14-1所示接種細(xì)菌，以接種環(huán)取產(chǎn)毒素白喉桿菌、類白喉桿菌和待檢的白喉桿菌分別以與濾紙條成垂直的方向劃線接種，接種線須密且集中，接種的菌量宜多。若用此法測未知標(biāo)本需設(shè)陽性對照(產(chǎn)毒株)及陰性對照(無毒株)，一般每個平板可接種5～6個標(biāo)本。置37℃培養(yǎng)24、48、72h觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
注意觀察在接種線兩側(cè)距濾紙條約1cm處有無與接種線呈45°角的白色沉淀線出現(xiàn)。有沉淀者，白喉桿菌毒力試驗陽性，該菌株產(chǎn)生白喉外毒素；無沉淀線者，白喉桿菌毒力試驗陰性，該菌株不產(chǎn)生白喉外毒素。
圖14-1 Elek平板毒力試驗
（四)動物毒力試驗
【原理】
白喉外毒素對機體組織有損傷作用，使注射局部產(chǎn)生病變；白喉抗毒素可中和白喉外毒素的毒性。
【材料】
1．產(chǎn)毒素的白喉桿菌呂氏凝固血清斜面24h培養(yǎng)物。
2．白喉抗毒素、無菌肉湯、健康白色豚鼠。
3．注射器、針頭(4號)、5ml無菌刻度吸管、碘酒、酒精、鑷子、剪刀等。
【方法】
1．在菌種管內(nèi)加入4～5ml無菌肉湯，輕輕將菌苔洗下，制成細(xì)菌懸液(約5億/m1)，吸出，置于無菌試管內(nèi)。
2．取健康白色豚鼠2只，分別標(biāo)記為試驗鼠與對照鼠。對照鼠在試驗前18～24h自腹腔m.52667788.cn/jianyan/內(nèi)注射白喉抗毒素1000u。
3．給2只豚鼠腹部剃毛，局部皮膚消毒后皮內(nèi)各注射白喉桿菌懸液0.1ml。注射后24、48、72h觀察注射部位的局部反應(yīng)。
【結(jié)果】
試驗鼠于注射局部呈現(xiàn)紅腫與壞死，對照鼠的注射局部無明顯反應(yīng)。待測白喉桿菌的動物毒力試驗必須設(shè)立陽性對照和陰性對照，每鼠可同時檢測6～7個標(biāo)本。
