天熱藥物化學(xué)-實驗指導(dǎo)

藥渣  濾液

加pH8（用石灰水  滴加10％HCl調(diào)pH=4~5 ,放置

調(diào))水溶液250ml  充分冷卻，待沉淀完全后，抽濾，

煮提10min，趁熱過濾  沉淀用水洗至中性，自然干燥，稱重。

合并

藥渣（棄去)  濾液

  沉淀（蘆丁粗品)

  【精制】   懸浮于蒸餾水（約600ml)中 

  加熱煮沸10min至溶液澄清，趁熱過濾

不溶物（棄去)濾液

  放置充分冷卻，抽濾

   沉淀用水洗至中性

沉淀（精制蘆丁)

（自然干燥后稱重)

注：取少量固體氧化鈣加水?dāng)嚢�，至有不溶物存在，放置，取上清液即為飽和石灰水�?/p>

2．蘆丁的水解

稱取精制蘆丁1g置于250 ml園底瓶中，加入1％ H₂SO₄100ml(V/V) 隔石棉網(wǎng)直火微沸回流約30min（注意觀察現(xiàn)象：未加熱時，瓶內(nèi)為混懸液，加熱后，混懸液逐漸變?yōu)槌吻逡�，繼續(xù)加熱，澄清液體又逐漸變?yōu)榛鞈乙骸?待水解完畢后，冷卻水解液。濾取沉淀，濾液保存于三角瓶中待作糖的檢識，所得沉淀用少許水洗除酸，干燥稱重，計算苷元與糖的重量比。沉淀用乙醇（95%大約10-20ml)進(jìn)行重結(jié)晶，即得苷元（槲皮素)。

3．槲皮素乙酰化物的制備

取槲皮素200mg，置于50ml圓底燒瓶內(nèi)，加入4ml無水吡啶，于水浴上加熱回流，使其完全溶解，再加入5ml醋酐，搖勻，水浴上加熱回流30min，放冷，將反應(yīng)液在攪拌下傾入150ml冰水中，一直攪拌至油滴消失，固體沉淀析出，抽濾析出的白色沉淀，用水洗至中性，干燥，再用95％乙醇重結(jié)晶，得細(xì)針狀結(jié)晶，測定其熔點(diǎn)，并與文獻(xiàn)記載的五乙�；�槲皮素的熔點(diǎn)（193～195℃)對比。

4．色譜檢識

   （1)糖的紙色譜檢識

糖溶液的處理： 取水解蘆丁時的濾液20ml，加適量Ba(OH)₂細(xì)粉，邊加邊攪拌，使溶液調(diào)到中性（pH＝7)，用玻璃漏斗過濾至蒸發(fā)皿中，在水浴上濃縮至約2ml左右，供紙色譜點(diǎn)樣用。

點(diǎn)樣： 標(biāo)準(zhǔn)品：葡萄糖、鼠李糖的水溶液（2mg/ml)。

  樣品液：酸水解濃縮液

展開劑：  ① 正丁醇：冰醋酸：水（4:1:2不分層)配制14ml

② 正丁醇：冰醋酸：水（4:1:5取上層)配制5倍，放到分液漏斗中，平衡后取上層。

展開方式： 用徑向紙色譜法，操作見《實驗技術(shù)操作規(guī)范》第3頁

顯色劑：  噴霧鄰苯二甲酸-苯胺試劑，用電吹風(fēng)加熱至出現(xiàn)棕褐色斑點(diǎn)。

色譜結(jié)果：  將樣品色斑與標(biāo)準(zhǔn)品色斑對照并計算R_f值，作出結(jié)論。

（2)蘆丁和槲皮素的色譜檢識

點(diǎn)樣： 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)蘆丁、槲皮素的乙醇溶液（1mg/10ml)

   樣品液：取少量自制的蘆丁、槲皮素放于試管中加少量95％乙醇，水浴加熱溶解。

制板： 制備硅膠G-CMC板，方法見《實驗技術(shù)操作規(guī)范》第4頁

展開劑： 乙酸乙酯：甲酸：水（8：1：1)

展開方式：上行法

顯色劑： 噴霧1％AlCl₃的乙醇溶液或在紫外燈（365nm)下觀察熒光。

色譜結(jié)果：將樣品色斑與標(biāo)準(zhǔn)品色斑對照并計算R_f值，給出結(jié)論。

5. 化學(xué)反應(yīng)檢識

（1)糖類成分的檢識反應(yīng)

①取4支試管，分別加入1％的葡萄糖溶液、1％的蔗糖溶液、1％的可溶性淀粉溶液和蒸餾水各1ml，各試管均加入α-萘酚試液2~3滴，混合后，沿試管壁加濃硫酸1ml，使硫酸層集于下層，觀察兩相溶液界面處的顏色，并比較4個試管反應(yīng)的異同。

②取一濾紙條（約12×3cm)，用鉛筆劃三個圓圈，于各圓圈內(nèi)分別點(diǎn)1％的葡萄糖溶液、1％的蔗糖溶液、1％的可溶性淀粉溶液一滴，待干燥后，噴霧鄰苯二甲酸－苯胺試劑，置100℃加熱數(shù)分鐘或用電吹風(fēng)加熱，觀察并比較三個圓圈斑點(diǎn)的顏色。

（2)黃酮類化合物的識別反應(yīng)

① 取3支試管，分別加入1％ 蘆丁、槲皮素的乙醇溶液和1％ 橙皮苷的甲醇溶液各1~2ml，再各加入1％ FeCl₃試液1滴，觀察現(xiàn)象。

② 取3支試管，分別加入1％ 蘆丁、槲皮素的乙醇溶液和1％ 橙皮苷的甲醇溶液各1~2ml，各均加少許鎂粉，混勻，分別緩緩滴加濃鹽酸（2~3滴)，觀察顏色變化情況。

③ 取3支試管，分別加入1％ 蘆丁、槲皮素的乙醇溶液和1％ 橙皮苷的甲醇溶液各1~2ml，再各加入α-萘酚試液2~3滴，混合后，沿試管壁加濃硫酸1ml，使硫酸層集于下層，觀察兩相溶液界面處的顏色。

④ 取2支試管，分別加入1％ 槲皮素的乙醇溶液和黃芩苷的乙醇飽和溶液各1~2ml，然后加入2% ZrOCl₂的甲醇溶液數(shù)滴，注意觀察顏色變化情況；再繼續(xù)向試管中加入2%檸檬酸的甲醇溶液，觀察顏色變化情況。

⑤ 取一濾紙條(12×3cm)，用鉛筆劃三個圓圈，于各圓圈內(nèi)分別點(diǎn)1％的蘆丁、1％的槲皮素和1％ 的橙皮苷溶液各一滴，干燥后，

a．在日光和紫外燈下觀察三個樣品的顏色，作好記錄；

b．將紙條放在水蒸氣流中1分鐘，再置氨氣流中片刻，觀察在日光和紫外燈下顏色變化；

c．將紙條放在通風(fēng)處放置10min后，再在日光和紫外燈下觀察顏色有什么變化；

d．最后再于三個圓圈部位噴霧1％ AlCl₃的乙醇溶液，干燥后，于日光和紫外燈下觀察顏色的變化。

⑥取一濾紙條（15×3cm)，用鉛筆劃三個圓圈，于各圓圈內(nèi)分別點(diǎn)1％的蘆丁、1％的槲皮素和1％的橙皮苷溶液各一滴，干燥后，噴霧0.5％ 醋酸鎂甲醇溶液，于90℃加熱5min，在日光和紫外燈下觀察有什么顏色變化。

6．蘆丁及槲皮素的紫外光譜測定

   （1)試劑的配制

a)甲醇鈉溶液（NaOMe)：取新切割的金屬鈉2.5g，小心分次加入到100ml干燥的光譜純的甲醇中，所得溶液密塞貯存于玻璃容器中。

b)無水醋酸鈉（NaOAc)：如有粉末狀無水NaOAc（A.R)，可直接供用。如無，則取醋酸鈉（NaOAc.3H₂O)置蒸發(fā)皿中，于120℃干燥2小時，粉碎即可。

c)硼酸（H₃BO₃)：在程序A的情況下，可直接取無水粉末狀H₃BO₃（A.R)。

在程序B的情況下，取光譜純MeOH，加入無水粉末狀H₃BO₃使成飽和溶液后供用。

d)無水三氯化鋁溶液（AlCl₃)：取1g無水AlCl₃（C.P)，小心加入到20ml光譜純甲醇中，放24小時后即溶解。

e)鹽酸（HCl)貯備液：取濃HCl（A.R)50ml，與蒸餾水100ml混勻后密塞貯存于玻璃中，備用。

以上貯備液可保存半年之久。取30ml滴瓶，每個滴瓶分別盛上述貯備液20ml，放于紫外分光光度計旁，供測定時用。

（2)測定方法：精密稱取蘆丁10mg于100ml容量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋到刻度，搖勻。從中吸取5ml于50ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻備用（20μg/ml)。

① 甲醇光譜：取樣品溶液置石英杯中，在200～550nm內(nèi)進(jìn)行掃描，重復(fù)一次，觀察紫外光譜。

② 甲醇鈉光譜：取樣品溶液置石英杯中， 加入3滴NaOMe貯備液后，立即測定“樣品+NaOMe”溶液的UV光譜，過5min后重新測定一次，以核對黃酮類化合物的分解情況。

③ AlCl₃光譜：在置有樣品溶液的石英杯中，加入6滴AlCl₃貯備液，停一分鐘測定“樣品+AlCl₃”溶液的UV光譜。然后加3滴鹽酸貯備液后，立即測定“樣品+AlCl₃/HCl”溶液的UV光譜，隨即倒掉杯內(nèi)溶液。

④ 醋酸鈉光譜：取樣品溶液2～3ml，加入粉碎的無水NaOAc振搖，至比色杯底約留有2mm厚的NaOAc時，立即測定“樣品+ NaOAc”溶液的UV光譜；然后再過5min作第二次測定，以核對分解情況。

⑤ 醋酸鈉-硼酸光譜：

方法Ⅰ，在盛有樣品及醋酸鈉的石英杯中，加入足量的硼酸使成飽和溶液，然后進(jìn)行測定。本法適用于在加入醋酸鈉5分鐘后無分解現(xiàn)象者。

方法Ⅱ，于樣品溶液約3ml中加入5滴H₃BO₃貯備液，然后加入NaOAc粉末，使之快速飽和后，測定“樣品+ NaOAc/H₃BO₃”的UV光譜。

根據(jù)測定結(jié)果試解析光譜并初步判斷其結(jié)構(gòu)，并說明理由。

四、思考題

1．提取蘆丁工藝中影響產(chǎn)量和質(zhì)量的因素是什么？

2. 提取苷類化合物時應(yīng)注意什么？

3．蘆丁和槲皮素用不同展開劑系統(tǒng)展開將出現(xiàn)什么結(jié)果？ 為什么？

實驗三  苦參生物堿的提取、分離、鑒別和生物堿的檢識

苦參為豆科(Leguminosae)植物苦參（Sophora flavescens Ait)的根，味苦性寒，有清熱利濕、袪風(fēng)殺蟲及解毒等功效。主要用于濕熱黃疸、赤白帶下、痛腫瘡毒、皮膚疥癬以及腮炎、痢疾等。

苦參中主要含有苦參堿、氧化苦參堿、N—甲基金雀花堿、氧化槐果堿、槐定堿等成分�？鄥⒖倝A及氧化苦參堿都具有減慢心率的作用，可用于心室早博等心律失常之癥，苦參制劑也常用于急性菌痢、滴蟲病、白細(xì)胞減少癥、皮膚騷癢等多種疾病。目前藥理實驗表明苦參堿、氧化苦參堿等具有抗腫瘤作用。

一、實驗?zāi)康暮鸵��?/b>

1．掌握離子交換法提取苦參生物堿的原理及方法

2．掌握連續(xù)回流提取法的基本操作。

3．了解陽離子交換樹脂的性能和處理方法

二、實驗原理（苦參生物堿的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)，綜合性實驗)

1．苦參堿（matrine)：有四種形態(tài)，α－苦參堿為針狀或柱狀結(jié)晶，mp. 76℃，[α]_D＋39°；β－苦參堿為柱狀結(jié)晶，mp. 84℃；γ－苦參堿為液體，bp. 223℃/6mmHg；δ－苦參堿是柱狀結(jié)晶，mp. 84℃。常見是的α－苦參堿。當(dāng)β－苦參堿在石油醚中22～24℃放置后，能析出α和β型苦參堿的混合結(jié)晶，而α－苦參堿的溶液放置在10℃時，能析出β-苦參堿結(jié)晶，用過氧化氫處理苦參堿可轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸�苦參堿。四種形態(tài)的苦參堿的苦味酸鹽相同，mp. 167～169℃。  

2．氧化苦參堿（Oxymatrine)：C₁₅H₂₄N₂O_2，無色柱狀結(jié)晶（Me₂CO)，mp.162～163℃（水合物)，207℃（無水物)。[α]_D+47.7°（EtOH)�？扇苡诶渌�、乙醇、氯仿，難溶于乙醚、石油醚。用SO₂處理可轉(zhuǎn)變?yōu)榭鄥�堿。

3．N－氧化槐果堿（N－Oxysophocarpine)：白色簇狀結(jié)晶，mp. 206℃

4．槐定堿（Sophoridine)：為苦參堿的一種空間異構(gòu)體，白色棱晶，mp. 106～108℃

苦參堿氧化苦參堿 N－氧化槐果堿  槐定堿

5．其它生物堿的結(jié)構(gòu)為：

（1)安那吉堿Anagyrine：穩(wěn)定性大，不被皂化，bp. 210～215℃／4mmHg

（2)苦參烯堿Sophocarpine：mp. 54℃

（3)苦參醇堿Sophoranol：mp. 171℃

   （1) （2) （3)

苦參生物堿是喹喏里西丁類生物堿，能與酸成鹽而溶于稀酸水，將其鹽的水溶液通過陽離子交換樹脂柱進(jìn)行交換，交換樹脂用濃氨水堿化，再用氯仿提取得到苦參總生物堿。 

三、實驗內(nèi)容

 （一)儀器與試劑

玻璃色譜柱（21mm×200mm)及配套分液漏斗，燒杯（50 ml，500 ml，1000m1)，滲漉筒，濾紙，紗布，100ml三角瓶，索氏提取器，恒溫水浴鍋，蒸發(fā)皿，試管，玻璃板（5×20cm)，色譜缸，濾紙，玻璃漏斗，鐵架臺， 250ml園底燒瓶，恒溫水浴鍋，抽濾瓶，布氏漏斗，冷凝器等。

苦參粗粉，732型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，硅膠G，乙醇，濃氨水，氯仿，無水硫酸鈉，丙酮，甲醇，2mol/L HCl，0.1％HCl，5％NaOH溶液，氫氧化鈉，乙醚， 5％ 鉬酸銨，濃硫酸，濃硝酸，漂白粉，碘化鉍鉀試劑，改良的碘化鉍鉀試液，碘化汞鉀試劑，硅鎢酸試劑，10％ 硫酸銅試劑，氯化汞乙醇溶液，0.1%H₂SO₄奎寧水溶液，0.1%H₂SO₄小檗堿水溶液，0.1%H₂SO₄阿托品水溶液，苦參生物堿水溶液（自制)，1％ 鹽酸麻黃堿水溶液，鹽酸小檗堿水溶液，氫溴酸東莨菪堿溶液，硫酸阿托品溶液等。

（二)實驗操作

總生物堿的提取

1．樹脂的處理  由于市售的陽離子交換樹脂為鈉型，同時含水量不足未充分膨脹，而往往含有雜質(zhì)，因此使用前需進(jìn)行轉(zhuǎn)型、除雜和吸水膨脹處理。

樹脂規(guī)格：732型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，交換容量：45毫克當(dāng)量，交聯(lián)度：1×7。

稱取40克干樹脂置于100ml三角瓶中，加少量酒精或水浸泡過夜，次日倒出酒精，用蒸餾水洗至溶液澄清，然后倒入交換柱中。先用約300ml（約8倍量)2mol/LHCl以5～6ml/min的速度進(jìn)行交換，使其轉(zhuǎn)為氫型，然后用水洗至流出液呈中性；接著再用約300ml（8倍量)5％NaOH水溶液以同樣速度使其復(fù)回鈉型，再用蒸餾水洗至液呈中性（必要時也可再重復(fù)一次鹽酸和氫氧化鈉的處理)，最后用300ml（8倍量)的2mol/LHCl進(jìn)行交換，使之轉(zhuǎn)為氫型，蒸餾水沖洗至中性，待用。

2．滲漉

稱取苦參粗粉150g，用適量0.1％HCl攪拌濕潤膨脹后，裝入滲漉筒中（滲漉筒底部鋪一層紗布)，藥材要分次加入，一層一層壓緊，壓力要均勻，不要太緊，裝完后上面蓋一張濾紙，用玻璃塞壓住，加0.1％HCl浸泡過夜。次日以0.1％HCl為溶劑以4～5ml/min的速度滲漉（滲漉液最好用濾紙過濾一次)，邊滲漉邊檢查生物堿反應(yīng)（或測定pH的變化)，至滲漉液生物堿反應(yīng)不明顯為止（滲漉液約1500左右，或滲漉液顏色較淺)。

注：（1)提取溶劑如酸度太大或用量過大，交換時可將吸附于樹脂上的生物堿洗脫下來，因此滲漉溶劑酸度和用量要合適。

（2)生物堿反應(yīng)檢查：將流出液滴在濾紙上，噴霧碘化鉍鉀試劑，如有橙紅色斑點(diǎn)為正反應(yīng)，無橙紅色斑點(diǎn)為負(fù)反應(yīng)。

3．交換

將滲漉液通過處理好的強(qiáng)酸性陽離子樹脂，交換速度為4～5ml/min，或以檢查流出液是否有生物堿來控制交換速度。交換完畢后，將樹脂倒入250ml燒杯中，用蒸餾水洗至洗液無色，再用乙醇洗兩次，將樹脂倒至蒸發(fā)皿中，自然晾干（或于40～50℃烤箱中烤干)。

4．連續(xù)提取

將上述晾干的樹脂放至燒杯中，加10ml左右的濃氨水拌濕（以手捏成團(tuán)但不粘手為宜)，內(nèi)置20min（蓋好)，裝入濾紙袋置索氏提取器中，用200ml的氯仿為溶劑連續(xù)回流提取至提取液無生物堿反應(yīng)，約2 h（于恒溫水浴中，水浴溫度為80～90℃)�；亓魍戤吅�，氯仿提取液加無水硫酸鈉（炒干)干燥脫水。干燥至少半小時以上過濾，回收氯仿至干（蒸至少量時倒入50ml燒杯中，繼續(xù)將氯仿?lián)]盡)，殘留物加入少量丙酮，熱溶，放置，析晶。數(shù)日后加少量丙酮處理結(jié)晶，抽濾（結(jié)晶用少量丙酮洗一次)，干燥，即得粗品總堿（黃白色結(jié)晶)。

5．精制

將粗品用約20倍的丙酮于100ml三角瓶中熱溶解，趁熱過濾，濾液放置冷卻。待沉淀完全后，抽濾，結(jié)晶用丙酮洗滌一次，置干燥器，稱重，即得以氧化苦參堿為主的精品總堿。

6．總堿的薄層色譜鑒定

制板：制備硅膠G-CMC板，方法見《實驗技術(shù)操作規(guī)范》第4頁

點(diǎn)樣：樣品液：取少量自制苦參總生物堿放于小試管中加適量氯仿溶解。

  母液；標(biāo)準(zhǔn)品：苦參堿和氧化苦參堿（用適量氯仿溶解)

展開劑：氯仿-甲醇-濃氨水（8:2:0.25)

展開方式：上行法

顯色劑：噴霧改良的碘化鉍鉀試液

色譜結(jié)果：對照樣品色斑與標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)的顏色和位置，計算R_f值，并觀察母液中有多少生物堿的斑點(diǎn)，做出結(jié)論。

7. 生物堿類化合物的檢識

生物堿除少數(shù)（如麻黃堿)外，均與各種生物堿沉淀試劑在弱酸性溶液中反應(yīng)，生成沉淀；而部分生物堿又各自與不同的顯色試劑反應(yīng)，生成各種有色物質(zhì)。

1)生物堿沉淀反應(yīng)

（1)碘化鉍鉀沉淀反應(yīng)：取4支試管，分別加入0.1%H₂SO₄奎寧水溶液、0.1%H₂SO₄小檗堿水溶液、0.1%H₂SO₄阿托品水溶液及苦參生物堿水溶液各1ml，然后在各試管中均加入碘化鉍鉀試劑，混勻，觀察生成沉淀的情況。

    （2) 碘化汞鉀反應(yīng)：取4支試管，分別加入0.1%H₂SO₄奎寧水溶液、0.1%H₂SO₄小檗堿水溶液、0.1%H₂SO₄阿托品水溶液及苦參生物堿水溶液各1ml，然后在各試管中均加入碘化汞鉀試劑，混勻，觀察生成沉淀的情況。

（3)硅鎢酸沉淀反應(yīng)：取4支試管，分別加入0.1%H₂SO₄奎寧水溶液、0.1%H₂SO₄小檗堿水溶液、0.1%H₂SO₄阿托品水溶液及苦參生物堿水溶液各1ml，然后在各試管中均加入硅鎢酸試劑，混勻，觀察生成沉淀的情況。

2) 顯色反應(yīng)  取一張濾紙條，在其上分別滴加0.1% H₂SO₄奎寧水溶液、0.1% H₂SO₄小檗堿水溶液、0.1% H₂SO₄阿托品水溶液及苦參生物堿水溶液各1滴，干燥后噴霧改良的碘化鉍鉀試劑，觀察各種樣品顯色情況。

 3)個別生物堿的顏色反應(yīng)

（1)麻黃堿的反應(yīng)：取一支試管加入1％ 鹽酸麻黃堿水溶液1ml，加入10％ 硫酸銅試劑2～3滴，用氫氧化鈉堿化，即顯蘭紫色；再往試管中加入乙醚，振搖分層后，醚層呈紫紅色（二水合物)，水層呈蘭色（四水合物)。反應(yīng)原理為：

（2)莨菪堿和東莨菪堿的反應(yīng)：

東莨菪堿與5％ 鉬酸銨的濃硫酸溶液加熱反應(yīng)，初生成黃色，后變?yōu)樘m色，阿托品不顯色。

取少量硫酸阿托品及氫溴酸東莨菪堿分別置2支試管中，加入氯化汞乙醇溶液，阿托品生成黃色沉淀，加熱后轉(zhuǎn)為紅色；東莨菪堿生成白色沉淀。

（3)小檗堿的反應(yīng)：

取鹽酸小檗堿水溶液2ml，加入濃硝酸數(shù)滴，可得黃綠色硝酸小檗堿沉淀。

取鹽酸小檗堿少許，加稀鹽酸2ml溶解后，加漂白粉少許即產(chǎn)生紅色。

四、思考題

1. 離子交換樹脂提取生物堿的原理是什么？其方法有什么特點(diǎn)？

2. 根據(jù)苦參生物堿的性質(zhì)，請設(shè)計用溶劑法提取苦參生物堿的流程。

3. 使用索氏提取器有什么優(yōu)點(diǎn)？應(yīng)注意哪些問題？

實驗四  利用紙色譜先導(dǎo)設(shè)計法從洋金花中提取分離生物堿

洋金花是茄科（Solanaceae)植物白曼陀（S.Daturametel  L.)或毛曼陀（S.Datura innoxia Mill)的干燥花，前者稱南洋金花，后者稱北洋金花。曼陀羅的葉、花、根和種子均含有大量生物堿（0.2～0.5％)，主要為莨菪堿（hyoscyamine)、東莨菪堿、顛茄堿和去水阿托品。在花中主要是莨菪堿和東莨菪堿。北洋金花中東莨菪堿的含量較高，約為0.344％。洋金花味辛性溫、有毒，具有定喘、麻醉止痛之功效，主治哮喘、驚癇、風(fēng)濕痹痛等，還可作手術(shù)麻醉劑。民間將洋金花與煙絲或煙葉混合，做成煙卷，用以治療老年性慢性氣管炎哮喘，對緩解支氣管平滑肌痙攣有明顯療效。

一、實驗?zāi)康?/b>

1．了解紙層析先導(dǎo)設(shè)計法的原理與操作

2．掌握洋金花中東莨菪堿和莨菪堿的理化性質(zhì)與提取分離方法

3．掌握逆流分溶法（CCD法)的原理與操作

二、實驗原理（綜合性實驗)

（一)洋金花中主要成分的結(jié)構(gòu)性質(zhì)及提取分離原理

1.東莨菪堿(hyosine or scopolamine)  為粘稠狀液體，其一分子水合物為結(jié)晶體，mp 59℃，[α]_D-18^o，具有極強(qiáng)的親水性，可溶于水（1:9.5)，易溶于熱水、乙醇、乙醚、氯仿、丙酮，難溶于四氯化碳、苯或石油醚。其堿性較弱(K_b=3.5×10^-7)，不能與HgCl₂生成HgO的黃色沉淀。

2.莨菪堿(hyocyamine or atropine)  為固體，mp 108. 5℃，[α]_D-22^o(EtOH)。其溶于無水乙醇中，加0.16％的氫氧化鈉或120℃加熱30min，經(jīng)消旋即可轉(zhuǎn)為阿托品。阿托品為長柱狀結(jié)晶，mp 118℃，易溶于乙醇、氯仿，可溶于四氯化碳、苯，幾乎不溶于石油醚。堿性比東莨菪堿強(qiáng)(K_b=4.5×10^-5)，能與HgCl₂生成黃色HgO沉淀，加熱后轉(zhuǎn)為紅色。

 莨菪堿  東莨菪堿

東莨菪堿和莨菪堿均能與酸成鹽而溶于水，在堿化后游離出生物堿而溶于氯仿，利用此性質(zhì)用酸水將洋金花中生物堿提取出來，堿化后用氯仿萃取得到總堿，而利用紙色譜先導(dǎo)法的方案將莨菪堿與東莨菪堿分離。

（二)紙色譜先導(dǎo)設(shè)計法簡介

紙色譜先導(dǎo)設(shè)計法是以紙色譜的結(jié)果及計算數(shù)據(jù)作指導(dǎo)，來設(shè)計液—液兩相萃取法分離天然藥物化學(xué)成分的研究方案。紙色譜屬于分配色譜，固定相和流動相分別為吸附在色譜濾紙上的水（或預(yù)先涂布的其它固定相)和展開劑，根據(jù)不同物質(zhì)在水相與有機(jī)相之間的分配系數(shù)不同而得到分離。因此我們可以根據(jù)不同成分紙色譜的比移值R_f來設(shè)計液—液萃取的實驗方案。

紙色譜先導(dǎo)法的設(shè)計程序分為四個步驟：

1. 溶劑系統(tǒng)的選擇：

(1)選擇提取溶劑：提取溶劑是指從藥材或水提液中提取某種（或某組)成分所用的溶劑。最佳的提取溶劑應(yīng)為紙色譜時該種（或該組)成分R_f值最大的展開劑。因為色譜的R_f值越大，分配系數(shù)K越大，萃取率就越高。所以，可用紙色譜法選擇其中R_f值最大的展開劑作為提取該物質(zhì)的最佳萃取溶劑。

當(dāng)采用潤濕指數(shù)為1.5的半濕色譜濾紙時，K值與R_f值的近似關(guān)系式如下所示：

  式中：K=C_{有機(jī)相}/C_水相

(2)選擇分離混合物的溶劑：在分離紙色譜比移值為R_f1及R_f2(R_f1 ＞R_f2)的兩個化合物時，可以用分離因子β表示這兩種化合物可分離的難易程度：

分離因子β越大，兩種物質(zhì)越易分離。因此在選擇分離溶劑系統(tǒng)時，應(yīng)盡量選β值大者的溶劑系統(tǒng)。一般情況下，ΔR_f越大，則β值越大越容易分離。當(dāng)在該條件下用紙色譜的展開劑做為萃取溶劑時，R_f值最大的化合物易轉(zhuǎn)入萃取溶劑中，而R_f小的化合物則留在水相中，從而達(dá)到了分離的目的。

分離混合物的溶劑還要具備下述條件：兩相溶劑能很快的分層；振搖時不易發(fā)生乳化現(xiàn)象；溶質(zhì)與溶劑不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)（特殊需要者例外)等。

選擇溶劑時具體做法如下：

①色譜濾紙的處理：稱量色譜濾紙重W₁，然后將色譜濾紙浸入蒸餾水(或其它固定相)中，迅速取出，夾于兩張濾紙中間。吸去多余水分，至濕潤的色譜濾紙重W₂約為W₁的1.5倍。此時濾紙的濕潤指數(shù)即為1.5。

②點(diǎn)樣展開及確定溶劑系統(tǒng)：取濕潤指數(shù)約為1.5的半濕色譜濾紙，按紙色譜常規(guī)點(diǎn)樣，并選用不同溶劑上行展開，最后顯色，計算樣品的R_f及β值，并據(jù)此確定最佳的溶劑系統(tǒng)。

2. 分離方法的確定

液-液萃取法分離化學(xué)成分主要有兩種操作方法：簡單萃取法(即分批萃取法Batchextraction)和逆流分溶法(Counter-CurrentDistribution簡稱CCD)。前者操作簡單，但分離效果較差；后者操作復(fù)雜，但分離效果好，可同時分離幾種成分組成的多元混合物及性質(zhì)極為相似的化合物。方法的確定主要依靠β值的大小，一般當(dāng)β＞50時說明混合物易于分離，在設(shè)計方案時可采用簡單萃取法；當(dāng)β＜50時宜用分離效果較高的CCD法。

3. 溶劑用量比的確定

在簡單萃取或逆流分溶過程中，溶劑用量比例要合適，這樣可以大大提高分離

效果。最適量的溶劑用量比例可由下公式得出：

R=V_{有機(jī)相}/V_水相 = 1/   V：體積

4.逆流分溶轉(zhuǎn)移次數(shù)的確定

用逆流分溶法分離混合物時需要的最經(jīng)濟(jì)的轉(zhuǎn)移次數(shù)N可用下式計算：

N=β[3(α+β)+δ(αβ+1)]²/α(β-1)²

式中α為溶劑因子，可由α=R²·K₁·K₂求出，其值與所達(dá)到的分離純度有關(guān)，純度要求越高，δ值越大(表1)，轉(zhuǎn)移次數(shù)N也越大。

表1 δ值與純度的關(guān)系

三、實驗內(nèi)容

1.儀器及試劑

三角瓶若干；分液漏斗100ml1個，50ml 4個；蒸餾裝置一套、培養(yǎng)皿、毛細(xì)管、試管，紙色譜筒，色譜濾紙，棉花。

洋金花；氯仿；濃鹽酸，濃氨水，改良的碘化鉍鉀試液；檸檬酸-碳酸氫鈉緩沖溶液（pH=5、6.5、7.5、8.5)四種；氫溴酸東莨菪堿對照品溶液，硫酸阿托品對照品溶液。

2.實驗操作

1)洋金花中總生物堿的提取

稱取洋金花(搓碎)15g，置于100ml三角瓶中，加蒸餾水80ml，滴加濃鹽酸調(diào)溶液pH=2，浸泡過夜。第二天抽濾，將濾液倒入125ml分液漏斗中，加20ml氯仿，用濃氨水堿化至pH=8～9，振搖萃取。再分別用20ml、10ml氯仿分別萃取兩次。合并三次氯仿萃取液，水層棄掉，回收氯仿，剩5～6ml即可(留1ml作紙色譜用)。

2)東莨菪堿與莨菪堿的分離

(1) 分離條件的考察  取一條15cm×5cm的色譜濾紙，用鉛筆距底端2cm劃起始線，再垂直于起始線畫三條等距縱線，即將濾紙分為四等分窄條。用棉球沾取不同pH的緩沖液（pH依次為5、6.5、7.5、8.5的檸檬酸-碳酸氫二鈉緩沖液)按順序涂布于濾紙的各條帶上，涂布操作要求均勻、快速，而且在盡量避免緩沖液間鄰近區(qū)間的擴(kuò)散。涂畢后將濕濾紙條夾在兩張干濾紙之間吸去多余的水分。然后用毛細(xì)管吸取總生物堿溶液分別點(diǎn)于色譜濾紙各條緩沖帶的起始線處。以水飽和的氯仿為展開劑，展開。展開高度約10cm后取出，以改良的碘化鉍鉀試劑噴霧顯色。記錄不同pH緩沖帶下樣品展開的R_f值和β值，根據(jù)此值選擇樣品中生物堿分離的適宜pH緩沖條件。

(2) CCD分離方法(Counter-Current Distribution) 取4個小分液漏斗，編號為1～4，每只內(nèi)盛有pH=6.5的緩沖溶液5ml做為固定相(緩沖溶液要用氯仿提前飽和)。將含有總堿的氯仿濃縮溶液5ml轉(zhuǎn)入第1號分液漏斗中，振搖后靜置分層；之后再將第1號分液漏斗中的氯仿層溶液轉(zhuǎn)入至第2號分液漏斗中，振搖后靜置分層；然后再將第2號分液漏斗中的氯仿層溶液轉(zhuǎn)入至第3號分液漏斗中，振搖后靜至分層；然后再將第3號分液漏斗中的氯仿層溶液轉(zhuǎn)入至第4號分液漏斗中，靜置后分層；最后將第4號分液漏斗中的氯仿層溶液收集至試管中（編號為第1號氯仿萃取液)。

再取5ml新配的氯仿液（提前用pH=6.5的緩沖溶液飽和)倒入第1號分液漏斗中，振搖后靜置分層；然后再將第1號分液漏斗中的氯仿層溶液轉(zhuǎn)入第2號分液漏斗中……。最后將第4號分液漏斗中的氯仿層溶液收集至試管中（編號為第2號氯仿萃取液)。重復(fù)上步驟工作，依順序得到編號為第3號、第4號的氯仿萃取液。共得到編號為1～4號的四份氯仿萃取液。

將第1至4號分液漏斗中的水相中各加入5ml氯仿，再分別加入氨水堿化至pH=9，振搖后靜置，分出氯仿層溶液，共得到編號為5～8的四份為水相堿化后的氯仿萃取液。將以上各氯仿萃取液（編號1～8，共8份)分別濃縮至小量后待紙色譜鑒定用。

3)紙色譜鑒定

取一張圓形紙色譜濾紙，在圓心處畫一直徑約為3cm的圓圈做為起始線。用棉球沾取pH=6.5的緩沖溶液均勻涂于一張圓形紙色譜濾紙上，用干濾紙吸去多余的水份，再按圓形紙色譜法操作。

點(diǎn)樣：洋金花總生物堿氯仿濃縮液(自提)，氫溴酸東莨菪堿對照品溶液，硫酸阿托品對照品溶液，編號1～4（流動相)、5～8（固定相)的氯仿萃取濃縮液。

展開劑：用pH=6.5緩沖溶液飽和的氯仿液。

顯色劑：改良的碘化鉍鉀試液，噴霧顯色。

注意觀察各樣品斑點(diǎn)情況，并分析各萃取液中的成分。

四、思考題

1. 在提取中為什么要先加氯仿再堿化？堿化后的pH值為什么要控制在8-9？

2. 萃取用的氯仿為什么要用pH=6.5的緩沖溶液飽和？

實驗五  一葉萩堿的分離和鑒定

大戟科植物一葉萩（Securinegasuffruticosa(Pall) Rehd)也稱葉底珠，別名狗杏條，我國資源十分豐富。其根、葉和嫩枝中均含有多種生物堿，結(jié)構(gòu)已經(jīng)清楚的有十幾種，其中一葉萩堿含量最高，并已用于臨床。一葉萩堿和它的衍生物能興奮中樞神經(jīng)，增強(qiáng)心肌收縮，升高血壓，臨床用硝酸一葉萩堿治療面神經(jīng)麻痹，小兒麻痹骶神經(jīng)炎和股外側(cè)神經(jīng)炎感染引起的多發(fā)性神經(jīng)炎，成為神經(jīng)科疾患的常見藥物。

一、實驗?zāi)康?/b>

1. 掌握用離子交換樹脂法提取分離生物堿的原理和方法。

2.了解一葉萩堿衍生物的制備方法及鑒定方法。

二、實驗原理（綜合性實驗)

一葉萩堿為淡黃色棱形晶體，難溶于水，易溶于醇、氯仿，較難溶于石油醚，其結(jié)構(gòu)如下：

一葉萩堿具有較強(qiáng)的堿性，能與酸成鹽而溶于稀酸水，將其鹽的水溶液通過陽離子交換樹脂柱進(jìn)行交換，交換樹脂用濃氨水堿化，再用氯仿提取得到總生物堿。

三、實驗內(nèi)容

1. 儀器與試劑

玻璃色譜柱（21mm×200mm)及配套分液漏斗，燒杯（50 ml，500 ml，1000m1)，滲漉筒，濾紙，紗布，100ml三角瓶，索氏提取器，恒溫水浴鍋，培養(yǎng)皿、蒸發(fā)皿，試管，玻璃板（5×20cm)，色譜缸，濾紙，玻璃漏斗，鐵架臺， 250ml圓底燒瓶，恒溫水浴鍋，抽濾瓶，布氏漏斗，冷凝器。

一葉萩，硅鎢酸試劑，碘化鉀試劑，碘化鉍鉀試劑，石油醚，氨水，氯仿，苯，乙醇，乙醚無水乙醇，10%硝酸無水乙醇液，無水乙醇，乙醚，碘甲烷，丙酮，甲醇，氧化鋁（堿性Ⅱ~Ⅲ，粒度＞200目)。

2. 實驗操作

1) 

2)生物堿的定性實驗

① 取滲漉液1ml，加硅鎢酸試劑數(shù)滴，產(chǎn)生淡黃色沉淀。

② 取滲漉液1ml，加碘化鉀試劑數(shù)滴，產(chǎn)生淡棕褐色沉淀。

③ 取滲漉液1ml，加碘化鉍鉀試劑數(shù)滴，產(chǎn)生棕紅色沉淀。

3)一葉萩堿衍生物的制備

  ① 硝酸一葉萩堿的制備

稱取一葉萩堿200mg，加6ml乙醚及9ml無水乙醇，使生物堿全部溶解，滴加10%硝酸無水乙醇液14ml，滴加乙醚至渾濁、放置，白色結(jié)晶析出后，過濾，結(jié)晶用無水乙醇-乙醚（1：1)洗滌數(shù)次、干燥，即得硝酸一葉萩堿。

硝酸一葉萩堿、無嗅、味苦，溶于水，難溶于醇。mp 222℃。

② 一葉萩堿的甲基化物的制備

稱取樣品100mg，碘甲烷（MeI)0.4ml及丙酮10ml水浴回流1h，放冷結(jié)晶析出后，過濾，結(jié)晶用乙醚洗滌，用MeOH-EtOH重結(jié)晶，獲得黃色針狀結(jié)晶，mp. 232℃。

反應(yīng)式：

4)鑒定

①  TLC  吸附劑：Al₂O₃（堿性Ⅱ~Ⅲ，粒度＞200目)

展開劑：a.氯仿-苯-乙醇 (25:25:2)；b.氯仿；c. 乙醚

② IR ν_max  1790cm^-1（不飽和內(nèi)酯環(huán)上的質(zhì)子)，1730 cm^-1（內(nèi)酯的羰基)

1620 cm^-1（雙鍵)

③ UVλ_max  256.6 nm，311.6nm

四、思考題

   1．用樹脂提取生物堿的原理是什么？為什么提取生物堿時必須考慮交聯(lián)度？

   2．用石油醚從樹脂上回流洗脫一葉萩堿的原理是什么？

實驗六 青蒿素的提取、分離和檢識

青蒿素是從中藥青蒿中分離得到的一個有抗瘧活性的倍半萜過氧化物，尤其對腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾具有速效和低毒的特點(diǎn)。

一、實驗?zāi)康?/b>

1.掌握從青蒿中提取、分離并鑒定青蒿素的方法。

2.學(xué)習(xí)柱色譜的操作方法

 二、實驗原理（綜合性實驗)

青蒿素（Artemisinin)是低極性的倍半萜過氧化物，因此可以用低沸點(diǎn)的溶劑如二氯甲烷、氯仿、乙醚、丙酮和石油醚(30~60℃)來提取。然后應(yīng)用層析和重結(jié)晶的方法來分離純化青蒿素。

  青蒿素

三、實驗內(nèi)容

1．儀器和試劑

  色譜柱，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，硅膠薄層板，展開缸，顯色試劑噴瓶，電吹風(fēng)，錐形瓶(50m1)等。

青蒿干燥的葉子，100~200目硅膠，石油醚，氯仿，乙酸乙酯，二氯甲烷，正己烷，乙腈(分析純)，5％香草醛-濃硫酸(硫酸-無水乙醇＝4:1)，

2. 實驗操作

1)提取分離方法

 青蒿干燥的葉子(粉碎)用沸點(diǎn)30~60℃的石油醚提取48小時．回收濃縮后得到棕黑色漿狀物。再用20m1氯仿溶解后，加入180m1的乙腈，過濾除去不溶部分，濾液減壓濃縮得到膠質(zhì)狀殘渣。將殘渣用200g（100-200目)硅膠進(jìn)行柱色譜分離，用7.5％乙酸乙酯-氯仿作為洗脫劑。從洗脫劑下來200m1之后開始收集流分，每瓶流分體積為40ml。流分用TLC進(jìn)行檢測。收集流分體積約300m1后，青蒿素被洗脫下來，為白色結(jié)晶。用二氯甲烷-正己烷(1:4)重結(jié)晶可得到青蒿素純品。

2)TLC鑒定

樣品：青蒿素的氯仿(或二氯甲烷)溶液

展開刑：7.5％乙酸乙酯：氯仿

顯色： 用5％香草醛—濃硫酸，可以觀察到青蒿素開始為黃色斑點(diǎn)，加熱后變成紫紅色斑點(diǎn)(R_f=0.66)。

注意事項：高溫易導(dǎo)致青蒿素產(chǎn)生大量降解產(chǎn)物，因此本實驗必須低溫提取回收，溫度不得超過60℃。

四. 復(fù)習(xí)題

1. 提取時為何使用乙腈？

2. 設(shè)計青蒿素提取分離的其它方法？

實驗七 穿心蓮內(nèi)酯的提取、分離、鑒定及亞硫酸氫鈉加成物的制備

  穿心蓮為爵床科植物穿心蓮(Andjrographis panicalata (Burmf)Ness)的全草或葉。具清熱解毒，涼血消腫作用，用于治療急性菌痢、胃腸炎、咽喉炎、尿路感染等。穿心蓮中含有多種苦味素，屬二萜類化合物，主要為穿心蓮內(nèi)酯、脫氧穿心蓮內(nèi)酯、高穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、穿心蓮?fù)�、穿心蓮�(fù)�等。其中穿心蓮�?nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯是穿心蓮抗菌消炎的主要有效成分。鑒于穿心蓮內(nèi)酯在水中的難溶性，將穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)行磺化、亞硫酸氫鈉加成和琥珀酸酐酯化等水溶性衍生物合成研究，克服了穿心蓮內(nèi)酯不溶于水的特性。

穿心蓮中主要成分的結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)

 1．穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide)：C₂₀H₃₀O₆，又稱穿心蓮乙素，為無色方型或

長方型結(jié)晶，mp 230~232℃，[a]_D²⁰ -126^。。味極苦，可溶于甲醇、乙醇、丙酮、吡啶，微溶于氯仿、乙醚，難溶于水及石油醚。

 2．脫氧穿心蓮內(nèi)酯(14-deoxy-andrographolide)：C₂₀H₃₀O₄，又稱穿心蓮甲素，為無色片狀或長方型結(jié)晶， mp l75~176.5℃，[a]_D -36(1％，氯仿)。味稍苦，可溶于甲醇、乙醇，丙酮、吡啶、氯仿、乙醚、苯、微溶水。 

 3．新穿心蓮內(nèi)酯（neo-andrographolide )：C₂₆H₄₀O₈，又稱穿心蓮丙素、穿心蓮新苷，為無色柱狀結(jié)晶，mp l67~168℃。無苦味，可溶于甲醇、乙醇、丙酮、吡啶，微溶于氯仿和水，不溶于石油醚。

穿心蓮內(nèi)酯 脫氧穿心蓮內(nèi)酯 新穿心蓮內(nèi)酯

一、實驗?zāi)康?/b>

1. 掌握穿心蓮內(nèi)酯類二萜化合物的理化性質(zhì)和提取分離方法。

2. 學(xué)習(xí)氧化鋁柱色譜的原理和操作方法。

3. 通過穿心蓮內(nèi)酯亞硫酸氫鈉加成，掌握使脂溶性產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為水溶性產(chǎn)物的一種方法。

二、實驗原理（綜合性實驗)

穿心蓮中的內(nèi)酯類化合物易溶于甲醇、乙醇．丙酮等溶劑，故利用此性質(zhì)選用乙醇提取之，穿心蓮中含有大量葉綠素，可用活性炭脫色法除去葉綠素類雜質(zhì)；利用穿心蓮內(nèi)酯與脫氧穿心蓮內(nèi)酯在氯仿中溶解度不同，初步將二者分離；利用穿心蓮內(nèi)酯與脫氧穿心蓮內(nèi)酯結(jié)構(gòu)上的差異，用氧化鋁柱分離二者，將穿心蓮內(nèi)酯制成亞硫酸氫鈉加成物以增加其在水中的溶解性。

三、實驗內(nèi)容

1．儀器和試劑

玻璃色譜柱（2×30cm)及配套分液漏斗，濾紙，50ml三角瓶數(shù)個， 恒溫水浴鍋，蒸發(fā)皿，玻璃板（5×20cm)，色譜缸，玻璃漏斗，鐵架臺，500ml園底燒瓶，抽濾瓶，布氏漏斗，冷凝器，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，硅膠薄層板，顯色試劑噴瓶，電吹風(fēng)，錐形瓶(50m1)等。

穿心蓮粗粉，95％乙醇，活性炭，丙酮，氯仿，甲醇，正丁醇，亞硫酸氫鈉，無水乙醇，0.3％亞硝酰鐵氰化鈉，10％的正丁醇?xì)溲趸�鈉溶液，3，5-二硝基苯甲酸堿性溶液，50％氫氧化鉀甲醇試液。

2. 實驗方法

 (一)內(nèi)酯類成分的提取

1)提�。悍Q取穿心蓮粗粉100g，置圓底燒瓶中，加95％乙醇以浸過藥粉2cm為度，回流1小時，過濾，藥渣再加適量乙醇回流2次，每次1小時，過濾，合并三次濾液，回收乙醇至總體積的1/5量，放冷，即為內(nèi)酯類成分總提取物。

2)脫色：將上述內(nèi)酯類成分總提取物加入原料量的15~30％活性炭，加熱回

流30分鐘，脫色后的溶液再濃縮至15~2ml左右，放置析晶。

 (二)分離、精制

 1)穿心蓮內(nèi)酯的分離結(jié)晶法，將活性炭脫色后的濃縮液放置析晶，濾取結(jié)晶，并用少量水洗滌即得穿心蓮內(nèi)酯粗品(含少量脫氧穿心蓮內(nèi)酯)。母液待分離脫氧穿心蓮內(nèi)酯。

 2)穿心蓮內(nèi)酯的精制將粗品穿心蓮內(nèi)酯結(jié)晶加40倍量丙酮，加熱回流l0分鐘，過濾不溶物再加20倍量丙酮，加熱回流l0分鐘，過濾，合并二次丙酮液，回收丙酮至三分之一量，放置析晶，濾取白色顆粒狀結(jié)晶，即為穿心蓮內(nèi)酯精品。做薄層鑒定。

 3)脫氧穿心蓮內(nèi)酯分離

將結(jié)晶法析出的穿心蓮內(nèi)酯母液水浴蒸發(fā)至稠膏狀，再加氯仿70ml，盡力攪拌后濾出氯仿層，殘渣再加氯仿10ml同法處理。合并二次濾液，水浴回收至5ml，將此濃縮液上氧化鋁柱(2×30cm)。用中性氧化鋁約30~35g，氯仿濕法裝柱，用氯仿洗脫，控制流速為2~3ml/分，每份10ml，約收12~15份。各流份濃縮后簿層鑒定，合并相同流份，蒸干氯仿，用丙酮結(jié)晶二次，得白色結(jié)晶即為脫氧穿心蓮內(nèi)酯，做薄層鑒定。

(三)穿心蓮內(nèi)酯亞硫酸氫鈉加成物的制備

取穿心蓮內(nèi)酯精制品0.5g置50ml圓底燒瓶中，加95％乙醇5ml及計算量的4％的亞硫酸氫鈉水溶液，加熱回流30分鐘，反應(yīng)液蒸出乙醇，再加5mJ水溶解，冷卻后過濾，濾液用少量氯仿洗滌三次，水液濃縮至干。殘留物加乙醇l0~20ml溶解，濾除不溶物，乙醇溶液濃縮放置或抽松，得白色粉末。粗品用乙醇-氯仿重結(jié)晶得到穿心蓮內(nèi)酯亞硫酸氫鈉加成產(chǎn)物。

 (四)鑒定

 1)穿心蓮內(nèi)酯的鑒定：

(1) 物理常數(shù)：mp 230~232℃。

(2) 薄層色譜： 吸附劑：硅膠G-CMC。展開劑：氯仿-無水乙醇(20:1)。

顯色劑：碘蒸氣。結(jié)果：穿心蓮內(nèi)酯在常量下為一個斑點(diǎn)。

(3) 顯色反應(yīng)：

①亞硝酰鐵氰化鈉堿液反應(yīng)(Legal 反應(yīng))：取穿心蓮內(nèi)酯結(jié)晶少許放在比色板上，加乙醇0.2ml溶解，加0.3％亞硝酰鐵氰化鈉溶液2滴10％的氫氧化鈉溶液2滴。

②3，5-二硝基苯甲酸堿液反應(yīng)(Kedde 反應(yīng))： 取穿心蓮內(nèi)酯結(jié)晶少許，于比色板上，加乙醇0.2ml溶解，加3，5-二硝基苯甲酸堿性溶液2滴，呈紫色。

③50％氫氧化鉀甲醇試液反應(yīng)：穿心蓮內(nèi)酯遇氫氧化鉀甲醇溶液呈紫色。

2)脫氧穿心蓮內(nèi)酯的鑒定：

  (1) 測熔點(diǎn)：mp l75~ 176.5 ℃。

   (2) 薄層鑒定：條件同穿心蓮內(nèi)酯。

3)穿心蓮內(nèi)酯亞硫酸氫鈉加成物的鑒定：

  (1) 測熔點(diǎn)：mp 226~227℃。

   (2) 薄層鑒定：吸附劑，硅膠G-CMC板。

   展開刑：A.氯仿-甲醇(9:1)，B.氯仿-正丁醇-甲醇(2:1:2)，C.氯仿-丙酮-乙醇-水(5:5:5:1)。顯色劑：3、5-二硝基苯甲酸堿性溶液 。

   樣品：①穿心蓮內(nèi)酯乙醇液  ②穿心蓮內(nèi)酯亞硫酸氫鈉加成物。

   結(jié)果：用展開劑A，樣品②留在原點(diǎn)、用展開劑B、C，樣品①移至前沿，樣品②R_f值在0.5左右。

四、復(fù)習(xí)題

   1. 根據(jù)穿心蓮內(nèi)酯類成分的不同結(jié)構(gòu)，判斷各自的極性大小，分析出各成分在薄層板上的R_f值。

   2．試說明穿心蓮內(nèi)酯顯色反應(yīng)的機(jī)理。

實驗八  黃芩苷的提取分離

（ 設(shè)計性實驗)

一. 概述

   黃芩苷是中藥黃芩中具有抗菌作用的主要有效成分，對革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌有抑制作用，臨床上用于上呼吸道感染，急性扁桃腺炎、急性咽炎、肺炎及痢疾等疾病。近年來報導(dǎo)用以治療肝炎，有降低轉(zhuǎn)氨酶的作用，如市售中成藥銀黃口服液、銀黃片中的主要成分之一是黃芩苷。

   黃芩為唇形科植物黃芩(Scutellaria baica lensls Georg．)的根。從黃芩醫(yī)學(xué)招聘網(wǎng)根中提

取分離出的黃酮類成分有6種，黃芩素(5，6，7-三羥基黃酮)及其苷(C7-葡萄糖醛

酸)、漢黃芩素(5，7-二羥基-8-甲氧基黃酮)及其苷(C7-葡萄糖醛酸)、7-甲基黃芩素及5，8-二羥基-7-甲氧基黃酮．其中以黃芩苷(Baicalin)含量最高，而漢黃芩素(Wo

gonln)則是我國黃芩中所特有的成分。

二. 實驗?zāi)康?/b>

1. 學(xué)習(xí)查閱天然藥物化學(xué)主要文獻(xiàn)資料的方法

2．通過分析文獻(xiàn)資料結(jié)合所學(xué)知識，自己設(shè)計并實施提取分離黃芩苷，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定的方法，以提高學(xué)生獨(dú)立思考和解決問題的能力。

三. 文獻(xiàn)綜述

要求學(xué)會系統(tǒng)查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)的方法，有詳細(xì)的閱查記錄及資料，后寫出綜述，綜述內(nèi)容如

1．黃芩的植物來源、品種、科屬及分布

2．黃芩苷的臨床應(yīng)用和藥理活性研究概況。

3．黃芩中主要化合物的名稱、熔點(diǎn)、結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、提取分離方法、結(jié)構(gòu)鑒定手段。

四. 提取分離方法設(shè)計  

1．根據(jù)文獻(xiàn)資料及所學(xué)有關(guān)知識簡述提取純化分離黃酮類化合物的方法。

2．設(shè)計提取純化黃芩苷方法 。

3．列出所需實驗材料的名稱及規(guī)格，并安排實驗進(jìn)度。

五. 黃芩苷的結(jié)構(gòu)鑒定

1．簡述檢查一個化合物純度的方法，黃酮結(jié)構(gòu)鑒定程序，用化學(xué)和波譜方法確定其結(jié)構(gòu)的途徑。

2．根據(jù)黃芩苷的結(jié)構(gòu)提出鑒定其結(jié)構(gòu)的具體方案。

3．將各方案于全組討論，優(yōu)選好的方案進(jìn)行實驗。

六. 總結(jié)與討論 

附錄一   常用試劑的配制及使用方法

一、生物堿沉淀試劑

1. 碘化鉍鉀試劑（Dragendorff試劑)

溶液Ⅰ：0.85g次硝酸鉍溶于10ml冰醋酸與40ml水中。

溶液Ⅱ：8g碘化鉀溶于20ml水中。

制備液：溶液Ⅰ與Ⅱ等體積混合，可于棕色瓶中保存較長時間，一般制備液可作為沉淀劑用。

噴霧劑：1ml制備液和2ml醋酸及10ml水臨用前混合即得。生物堿和某些含氮化合物顯桔紅色斑點(diǎn)。

2. 碘化汞鉀試劑（Mayer試劑)

制備液：1.36g氯化汞和5g碘化鉀各溶于20ml水中，等體積混合后稀釋至100ml。

顯色劑：制備液加1/10體積的17％鹽酸。

3. 碘-碘化鉀試劑（Wager 試劑)

  1g碘和10g 碘化鉀溶于50ml水，加熱，加2ml冰醋酸，用水稀釋到100ml。

4. 硅鎢酸試劑（Bertrand 試劑)

5g硅鎢酸溶于100ml水中，加10％鹽酸至pH2左右。

5. 磷鉬酸和磷鎢酸試劑

顯色劑：5~10％的磷鉬酸或磷鎢酸的乙醇溶液。噴灑后120℃加熱。

沉淀劑：磷鉬酸鈉20g溶于硝酸中，加水使成10％溶液。

二、酚類檢識試劑

1.三氯化鐵試劑：1~5％三氯化鐵的水溶液或乙醇溶液，并加少許鹽酸。

2. 鐵氰化鉀－三氯化鐵試劑：

溶液Ⅰ：2％鐵氰化鉀水溶液

溶液Ⅱ：1％三氯化鐵水溶液

臨用前溶液Ⅰ與溶液Ⅱ等體積混合。

3.  4-氨基安替比林-鐵氰化鉀試劑（Emerson反應(yīng))

   噴霧劑Ⅰ：2% 4-氨基安替比林乙醇溶液

噴霧劑Ⅱ：8％ 鐵氰化鉀水溶液

先噴溶液Ⅰ，再噴溶液Ⅱ后，將薄層板放于含有25%氨水的密閉容器中顯紅橙色～淡紅色。

4. Gibb’s試劑：溶液Ⅰ：0.5％2，6-二溴（氯)苯醌－氯亞胺乙醇溶液。

溶液Ⅱ：硼酸－氯化鉀－氫氧化鉀緩沖液（pH9.4)

三、內(nèi)酯、香豆素類的試劑

 1.異羥肟酸鐵試劑：

溶液Ⅰ：7％鹽酸羥胺甲醇溶液。

溶液Ⅱ：10％氫氧化鉀甲醇溶液。

溶液Ⅲ：1g三氯化鐵溶于1％鹽酸100ml中。

試管反應(yīng)時先加Ⅰ、Ⅱ，然后再加Ⅲ。

作顯色劑時將Ⅰ、Ⅱ兩液按1:2比例混合，過濾，用濾液噴灑，再噴灑溶

液Ⅲ。

四、黃酮類檢識試劑  

1. 氨氣

2. 氫氧化鉀試劑：10％氫氧化鈉或氫氧化鉀水溶液

3. 1％或5％碳酸鈉溶液

4. 三氯化鋁試劑（Aluminum chloride)：1％或5％三氯化鋁的乙醇溶液。

5. 醋酸鎂試劑：0.5～2％醋酸鎂的甲醇溶液。

6. 鋯－枸櫞酸試劑：

試劑Ⅰ：2％的二氯氧鋯（ZrOCl₂)甲醇溶液。

試劑Ⅱ：2％的枸櫞酸甲醇溶液。

使用時分別加入試劑Ⅰ和Ⅱ。

7. 三氯化銻試劑：10％三氯化銻的氯仿溶液，100℃烤5分鐘。

五、蒽醌類檢識試劑

1. 氨氣

2. 氫氧化鉀試劑：10％氫氧化鉀水溶液。

3. 醋酸鎂試劑：5％醋酸鎂甲醇溶液。

4. 1％硼酸試劑：1％硼酸水溶液。

六、強(qiáng)心苷類檢識試劑

1. 3，5二硝基苯甲酸（Kedde)試劑

溶液Ⅰ：2％3，5二硝基苯甲酸甲醇溶液。

   溶液Ⅱ：1mol/L氫氧化鉀甲醇溶液或5％氫氧化鈉乙醇溶液。

   應(yīng)用前試劑Ⅰ、Ⅱ等量混合。強(qiáng)心苷顯紫紅色，幾分鐘后退色。

2. 亞硝酰鐵氰化鈉－氫氧化鈉（Legal)試劑

  溶液Ⅰ：0.5％亞硝酰鐵氰化鈉水溶液。

溶液Ⅱ：10％氫氧化鈉溶液。

檢識反應(yīng)時，先將樣品蒸干，溶于吡啶，加溶液Ⅰ，搖勻后再加溶液Ⅱ。

3. 堿性苦味酸（Baljet)試劑

溶液Ⅰ：3.6％苦味酸甲醇溶液。

  溶液Ⅱ：1％氫氧化鈉溶液。

  使用時溶液Ⅰ和溶液Ⅱ以10:1混合。

4. 氯胺T－三氯醋酸試劑

 3％氯胺T水溶液及25％三氯醋酸的乙醇液以1:4混合。臨時用新配。

七、皂苷類檢識試劑

1.醋酐-濃硫酸（Liebermann)試劑

溶液Ⅰ：醋酐

溶液Ⅱ：濃硫酸

樣品蒸干溶于醋酐，沿管壁小心加入濃硫酸。

2.磷鉬酸試劑：25％磷鉬酸乙醇溶液，噴霧后140℃加熱5～10分鐘，皂苷元均呈深藍(lán)色。

3.10％硫酸乙醇溶液

八、萜和甾體類化合物的試劑

1. 香草醛-濃硫酸試劑 5％香草醛-濃硫酸液或0.5g香草醛溶于100ml硫酸-乙醇（4:1)中。

2. 三氯化銻試劑  25g三氯化銻溶于75g氯仿中。

3. 三氯醋酸試劑  3.3g三氯醋酸溶于10ml氯仿，加入1~2滴過氧化氫溶液。

九、糖類檢識試劑

1. α-萘酚－濃硫酸（Molish)試劑

1g α-萘酚溶于10ml乙醇中。

在試管中加1~2滴α-萘酚醇液，沿壁緩慢加濃硫酸1ml，界面處有紫環(huán)，即為糖的正反應(yīng)。

2. 茴香醛－硫酸試劑

濃硫酸1ml加到含茴香醛0.5ml的乙醇溶液50ml中，需臨用前配制。噴霧后100～105℃烤，各種糖顯不同顏色。

3. 苯胺－鄰苯二甲酸試劑

將0.93g苯胺和1.66g鄰苯二甲酸溶于在100ml水飽和的正丁醇中。噴霧后105℃加熱10分鐘。

4. 堿性酒石酸銅（Fehling)試劑

試劑Ⅰ：硫酸銅結(jié)晶6.23g，溶于100ml水中。

試劑Ⅱ：酒石酸鉀鈉結(jié)晶34.6g，氫氧化鈉10g溶于100ml水中，貯存于具塞的試劑瓶中。使用時Ⅰ、Ⅱ兩液等量混合。

5. 氨性硝酸銀（Tollen)試劑：

硝酸銀1g加水20ml溶解，注意滴加適量的氨水，隨加隨攪拌，至開始產(chǎn)生沉淀將近全溶為止，過濾。

6. 三氯化鐵－冰醋酸（Keller－Killiani)試劑

試劑Ⅰ：1％三氯化鐵溶液0.5ml，加冰醋酸至100ml。

試劑Ⅱ：濃硫酸  使用時分別加入兩液。

7. 呫噸氫醇－冰醋酸（Xanthydrol)試劑

10mg呫噸氫醇溶于100ml冰醋酸（含1％的鹽酸)中。

十、有機(jī)酸檢識試劑

1. 溴甲酚紫試劑  藍(lán)色背景上顯黃色。

   溴甲酚綠0.04g溶于50％乙醇100ml，用0.1N氫氧化鈉溶液調(diào)至pH10.0。

2. 溴酚藍(lán)試劑  0.04％溴酚蘭乙醇溶液，用0.1N氫氧化鈉溶液調(diào)至微堿性。

十一、氨基酸檢識試劑

茚三酮（Ninhydrin)試劑

0.3g茚三酮溶于正丁醇100ml中，加醋酸3ml或0.2g茚三酮溶于100ml乙醇或丙酮中。噴霧后加熱至出現(xiàn)顏色。

附錄二  常用有機(jī)溶劑的性能

1．甲醇 Methanol（Methyl alcohol   MeOH )CH₃OH

  無色易揮發(fā)易燃的液體，能與水和多種有機(jī)溶劑如醇類、乙醚、苯等混溶，易被氧化或脫氫而成甲醛，常用作溶劑或色譜展開劑。

   注意：甲醇蒸氣與空氣形成爆炸性化合物，爆炸極限6.0～36.5％（體積)。甲醇引起暈厥、抽搐，神經(jīng)的損害以及視力障礙和失明，飲后能致目盲。

2．乙醇 Ethanol（Ethyl alcohol  EtOH)CH₃CH₂OH

   無色透明易揮發(fā)和易燃然燒的液體，溶于水及各種醇、乙醚、苯、氯仿、石油醚等有機(jī)溶劑，有吸濕性，乙醇對很多化合物溶液度較好，為一種常用溶劑。

   注意：乙醇蒸氣和空氣混合能析出爆炸性混合物，爆炸極限3.5～18％（體積)。

3．丙酮  Acetone（Me₂CO)CH₃COCH₃

   無色易揮發(fā)易燃的液體，有微香氣味，能與水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、吡啶等混溶，對有機(jī)化合物溶解度較好，為常用溶劑。

注意：丙酮蒸氣和空氣混合能析出爆炸性混合物，爆炸極限2.55～12.8％（體積)。

4．三氯甲烷（氯仿)Chloroform  CHCl₃ 

無色透明易揮發(fā)的液體，稍有甜味。不易燃燒。微溶于水，溶于乙醇、乙醚、苯、石油醚等有機(jī)溶劑，對有機(jī)化合物溶解度較好，為常用溶劑。

注意：氯仿不能與金屬鈉接觸，因為有爆炸的危險。氯仿主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，有麻醉作用，長期接觸氯仿可引起肝臟損害。

5．乙酸乙酯（醋酸乙酯) Ethyl  acetate（EtOAc)CH₃COOCH₂H₅

   無色可燃性液體，有果子香氣，易燃，微溶于水，溶于乙醇、氯仿、乙醚和苯等，遇堿加溫水解，常用作溶劑及抽提黃酮類等成分的萃取劑。

注意：乙酸乙酯蒸氣和空氣混合能析出爆炸性混合物，爆炸極限2.2～11.2％（體積)。

6．乙醚Ether （Et₂O)C₂H₅OC₂H₅
   易燃易流動的無色透明液體，難溶于 水，遇乙醇、石油醚、氯仿等有機(jī)溶劑能任意比例相溶。常用作溶劑及抽提脂溶性成分的萃取劑。

   注意： 乙醚極易揮發(fā)和著火。蒸氣和空氣混合能析出爆炸性混合物，爆炸極限1.85～36.5％（體積)。蒸氣能使人失去知覺甚至死亡。

7．苯 Benzene C₆H₆

無色易揮發(fā)易燃燒的液體,有芳香氣味。不溶于水,溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑。

注意： 苯蒸氣和空氣混合能析出爆炸性混合物，爆炸極限1.5～8.0％（體積)。苯的毒性主要是對造血系統(tǒng)的損害，早期中毒表現(xiàn)為白細(xì)胞數(shù)的持續(xù)降低和頭暈、乏力等。

8．石油醚 petroleum ether

   石油醚是低分子量的烴類（主要是戊烷和己烷)的化合物，和汽油相同，只是比汽油所含雜志少，組分較簡單。無色澄清，有象乙醚的氣味。不溶于水，溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑，對脂類成分溶解度大。實驗室使用石油醚沸點(diǎn)范圍分為30～60℃（稱petroleum ether)60～90℃（稱petroleum benzine)90～120℃（稱ligroin)。

注意：容易揮發(fā)和著火。

9．正丁醇 n-butyl alcohol(n-BuOH) CH₃CH₂CH₂CH₂OH

無色液體，有酒的氣味。微溶于水，溶于乙醇和乙醚，用作溶劑和脫水劑及分離水溶性成分的萃取劑。

注意：蒸氣和空氣形成爆炸性混合物，爆炸極限3.7～10.2％（體積)。

10．己烷(正己烷) Hexane  CH₃(CH₂)₄CH₃

無色揮發(fā)性液體。有微弱的特殊氣味。極易揮發(fā)著火。不溶于水，溶于乙醇、氯仿、丙酮和乙醚。用作溶劑、展開劑，特別適用于萃取植物油。在60～70℃沸程的石油醚中，主要為正己烷，因此在許多方面可以用該沸程的石油醚代替正己烷作溶劑。

注意：己烷和空氣混合物的爆炸極限1.8～8％（體積)。

11．二氯甲烷 Dichloromethane  CH₂Cl₂

  無色透明揮發(fā)性液體。有刺激性芳香氣味。蒸氣不燃燒。微溶于水，能與醇、醚混合。主要代替易燃的石油醚、乙醚。

注意：二氯甲烷蒸氣與空氣形成爆炸性混合物，爆炸極限6.2～15.0％（體積)。不能用金屬鈉干燥，否則有爆炸的危險。

12．甲苯 Toluene  C₆H₅CH₃

無色易揮發(fā)性液體，有芳香氣味。難溶于水，溶于乙醇、乙醚和丙酮。用作溶劑或色譜用展開劑。

注意：蒸氣與空氣形成爆炸性混合物，爆炸極限1.2～7.0％（體積)。毒性同苯。

13．乙酸（醋酸) Acetic acid （HAc)CH₃COOH

無色澄清液體，有刺激性氣味。溶于水、乙醇和乙醚。無水的醋酸在低溫下似固體塊狀，俗稱冰醋酸。普通的醋酸約含純醋酸36％，常用作紙色譜的展開劑。

注意：醋酸與空氣混合物中含量超過4％ （體積)時可引起爆炸。醋酸碰到皮膚產(chǎn)生水皰。

14．甲酸（蟻酸)  Formic acid  HCOOH

無色而有刺激性的液體，溶于水、乙醇、乙醚和甘油。有還原性，易被氧化成水和二氧化碳。常作色譜用展開劑。

注意：甲酸有強(qiáng)烈腐蝕性，能刺激皮膚起泡。

15．吡啶（氮雜苯) Pyridine

無色或微黃色液體，有特殊氣味。溶于水、乙醇、乙醚、苯、石油醚和動植物油。是許多有機(jī)化合物的優(yōu)良溶劑。

注意：蒸氣與空氣形成爆炸性混合物，爆炸極限1.8～12.4％（體積)。吡啶對皮膚有刺激作用，可引起濕疹樣的皮膚損害。吸入吡啶蒸氣可出現(xiàn)頭暈、惡心和肝腎損害，大量吸入能麻痹中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

16．甲酰胺  Formanide  HCONH₂

無色澄清油狀液體，溶于水、低級醇和二元醇，不溶于烴類和乙醚。油吸濕性。與醇類共熱成甲酸酯，常用作溶劑或聚酰胺柱色譜時洗脫劑。

注意：甲酰胺不能用硫酸鈣干燥，因能被溶解，溶液程膠狀。

17．二甲基甲酰胺 Dimethyl  Formanide  HCON（CH₃)

無色液體。有氨的氣味。與水和大多數(shù)有機(jī)溶劑可任意混溶�；瘜W(xué)和熱穩(wěn)定性良好，對有機(jī)和無機(jī)化合物的溶解范圍廣，常用作溶劑和聚酰胺柱色譜分離黃酮類成分的洗脫劑。

注意：應(yīng)避光保存，否則會慢慢分解為二甲胺和甲醛，二甲基甲酰胺屬低毒類物質(zhì)。對皮膚和粘膜有輕度刺激作用，并能經(jīng)皮膚吸收。

18．乙腈（甲基氰) Acetonitrile CH₃CN

無色液體，有芳香氣味。乙腈和水、醇及乙醚可任意混溶。

注意：乙腈有毒、常含有相當(dāng)多的游離氫氰酸，這是其危險的主要原因。

19．二甲亞砜 Dimethyl Sulfoxide  (CH₃)₂SO

無色、無臭微帶苦味的強(qiáng)吸濕性液體。在常壓下加熱至沸騰可部分分解。能溶于水，溶于乙醇、丙酮、乙醚、苯和氯仿。

注意：二甲亞砜與某些物質(zhì)如氰化鈉、高氯酸鎂等混合時可能發(fā)生爆炸。

20．環(huán)己烷 Cyclohexane CH₂(CH₂)₄CH₂

無色液體。不溶于水,當(dāng)溫度高于57℃，能與水、乙醇、甲醇、苯、醚、丙酮等混溶。

21. 四氫呋喃 Tetrahydrofuran CH₂(CH₂)₂CH₂O

   無色透明液體，有乙醚氣味。溶于水和多數(shù)有機(jī)溶劑。易燃燒，在空氣中能形成爆炸性過氧化物。

常用溶劑的物理常數(shù)