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1 材料與方法
1.1 主要試劑
雷帕霉素(rapamycin，福建省微生物研究所)，環(huán)孢素A(CsA，Novartis公司)，普樂可復(fù)(FK506，日本藤澤制藥公司)，5氟尿嘧啶(5Fu，上海旭東海普藥業(yè)有限公司)，噻唑藍(lán)(MTT，Sigma公司)，Coulter DNAPrep Reagents Kit(Beckman Coulter公司)，Quantikine Mmouse VEGF Immunoassay試劑盒(R&D Systems公司)，Rat AntiMouse CD34(Southern Biotechnology Associates, Inc.)等。
1.2 方法
1.2.1 噻唑藍(lán)比色實(shí)驗(yàn)(MTT)
體外培養(yǎng)小鼠H22肝細(xì)胞癌株，分別與不同濃度的RPM(0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L)、CsA(1mg/L)、FK506(0.1mg/L)和5Fu(10mmol/L)在96孔培養(yǎng)板共同孵育48h后，每孔加入MTT(5mg/mL)20μL，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，離心后棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μL，振蕩10min，使活細(xì)胞內(nèi)的藍(lán)紫色結(jié)晶物充分溶解。選擇490nm波長(zhǎng)，以酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔的吸光度值(A)，記錄結(jié)果醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站m.52667788.cn。
1.2.2 細(xì)胞的周期變化測(cè)定
體外培養(yǎng)小鼠H22肝細(xì)胞癌株分別與不同濃度的RPM(0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L)、CsA、FK506和5Fu在24孔培養(yǎng)板共同孵育48h后終止孵育，700mL/L的冷乙醇固定60min。離心，PBS洗滌2次，加100μL的PBS重懸細(xì)胞，每份待檢細(xì)胞數(shù)1×106，分別加入DNAPrep Stain 400μL，常溫下染色20min。離心洗滌后將樣品用300目尼龍膜過濾。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，multicycle分析軟件對(duì)樣本進(jìn)行細(xì)胞周期分析。
1.2.3 VEGF含量的測(cè)定
用ELISA法測(cè)定各組上清液中VEGF含量。將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的小鼠肝癌細(xì)胞H22，以含20mL/L小牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液配成1×108 cells/L的細(xì)胞懸液，以每孔2×104 cells、200μL接種于96孔培養(yǎng)板上孵育24h，離心棄去孔內(nèi)上清液，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以含不同濃度藥物的培養(yǎng)液分別加入各孔內(nèi)，每一濃度重復(fù)6孔，孵育48h。離心，每孔吸取100μL上清液作為測(cè)試樣品-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩Ｒ勒赵噭┱f(shuō)明準(zhǔn)備所有的試劑、工作標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，通過分光光度儀讀取各孔的A值，并依此值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各孔內(nèi)樣品的VEGF濃度。
1.2.4 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
各組小鼠首先建立H22肝細(xì)胞癌皮下移植瘤模型，皮下移植瘤模型建立后當(dāng)天完成C57BL/6小鼠→BALB/c小鼠異體皮膚移植。RPM[1.5mg/(kg·d)、4.5mg/(kg·d)]、CsA[20mg/(kg·d)]、FK506[5mg/(kg·d)]和5Fu[50mg/(kg·d)]灌胃14d，觀察皮片存活情況，模型建立24d剖殺小鼠，留取血清及腫瘤組織。計(jì)算各組腫瘤體積，ELISA法測(cè)定各組小鼠血清中VEGF含量，通過CD34免疫組化染色測(cè)定各組腫瘤組織的微血管密度(MVD)。對(duì)照組用CMCNa 0.005mg/mL灌胃。
1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較用方差分析、LSD檢驗(yàn)、Dunnet t2 t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
