醫(yī)學免費論文:細胞間黏附分子1在紅霉素抗炎機制中的作用

1.2 細胞培養(yǎng) 人支氣管上皮細胞(16HBE)(美國加州大學)由中南大學湘雅醫(yī)學院細胞中心提供，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)體系6～10 ml，細胞密度1～2×106/ml接種于50 ml培養(yǎng)瓶，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞長滿70%～80%時隨機分為8組：①空白對照組，②TNF�拨�(20 ng/ml，16 h)組，③EM(0.3 μg/ml，24 h)+TNF�拨�(20 ng/ml，16 h)組，④EM(3 μg/ml，24 h)+TNF�拨�(20 ng/ml，16 h)組，⑤EM(30 μg/ml，24 h)+TNF�拨�(20 ng/ml，16 h)組，⑥EM(0.3 μg/ml，48 h)+TNF�拨�(20 ng/ml，16 h)組，⑦EM(3 μg/ml，48 h)+TNF�拨�(20 ng/ml，16 h)組，⑧EM(30 μg/ml，48 h)+TNF�拨�(20 ng/ml，16 h)組醫(yī).學.全.在.線m.52667788.cn。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT�睵CR)

1.3.1 提取細胞總RNA(按Trizol說明書) 取1 ml內(nèi)含1×106個細胞的培養(yǎng)液于1.5 ml Eppendorf離心管中，4℃，2 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入1 ml Trizol分離試劑，用移液器吸頭吸打重懸細胞沉淀，室溫孵育5 min。加入0.2 ml氯仿，振搖15 s，室溫孵育10 min。4℃，13 000 r/min離心15 min，收集上層無色水相于1.5 ml Eppendorf管中，棄沉淀管。加入0.5 ml異丙醇，振蕩混勻，室溫孵育5 min。4℃，13 000 r/min離心10 min，棄上清液。加入1 ml 75%乙醇并震蕩。4℃，13 000 r/min離心10 min，棄上清液。真空干燥離心機干燥5 min。加入8 μl DEPC處理水溶解RNA。取2 μl電泳分析RNA質(zhì)量。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄反應 各組提取的總RNA重懸于6 μl DEPC水中，加入8 U RNasin，Oligod T15(500 ng/μl)，ICAM��1下游引物50 pmol，混勻，13 000 r/min離心30 s，70℃水浴5 min，然后立即置冰上冰浴(退火)。20 μl RT反應體系中含5×RT緩沖液4 μl，12 U RNasin，4μl 2.5 mmol/L dNTPs，5 U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，然后用DEPC處理水補足終體積至25 μl，輕敲混勻，稍離心，42℃水浴1.5 h后，于-20℃保存。

1.3.3 聚合酶鏈反應(PCR) 取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，擴增β�瞐ctin、ICAM��1基因。ICAM��1，β�瞐ctin PCR反應條件：取RT反應產(chǎn)物2 μl為模板，加入10×PCR buffer 2μl，2.5 mmol/L dNTPs 2 μl，25 mmol/L MgCl2 1.5 μl，ICAM��1上游引物0.5 μl(10 pmol/μl)，β�瞐ctin上、下游引物各0.5 μl(10 pmol/μl)，補充消毒雙蒸餾水9 μl，再加入5 U/μl TaqE 1 μl，加入約25 μl左右的礦物油蓋于液面上。擴增參數(shù)為94℃，30 s，57℃，30 s，72℃，30 s，循環(huán)30次，然后72℃延伸10 min，停止，4℃保存。ICAM��1擴增片段長度為490 bp，β�瞐ctin擴增片段長度為260 bp。

1.3.4 cDNA�睵CR產(chǎn)物電泳和照相分析 取PCR產(chǎn)物5 μl，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以Generuler 100 bp DNA Ladder Marker為分子量標準，英國GENEGENIUS快速成像系統(tǒng)攝影，圖片經(jīng)英國GENEGENIUS圖像分析處理系統(tǒng)分析，對擴增產(chǎn)物條帶進行掃描，記錄光密度值，以ICAM��1/β�瞐ctin的比值作為ICAM��1 mRNA表達的相對含量。

1.4 克隆測序 回收ICAM��1擴增產(chǎn)物(PCR產(chǎn)物)，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收擴增目的片段;按產(chǎn)品說明書要求進行PCR產(chǎn)物與T載體連接反應，CaCl2法制備大腸桿菌DH5α新鮮感受態(tài)細胞100 μl，然后加入連接反應產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于氨芐青霉素陽性(100 μg/ml)LB固體培基平板上，37℃倒置平板過夜培養(yǎng);第二天挑取培養(yǎng)板上數(shù)個單克隆菌落，接種至氨芐青霉素陽性(100 μg/ml)LB液體培基(10 ml)，37℃，220 r/min，空氣搖床上振蕩培養(yǎng)過夜。取菌液1 μl為模板在50 μl體系中進行PCR擴增鑒定，隨機挑選獲陽性擴增結(jié)果者送樣至上海博亞生物技術(shù)公司進行序列分析。

2 結(jié) 果

2.1 RT�睵CR結(jié)果 TNF�拨链碳�16HBE16 h后，與空白對照組比較，ICAM��1 RT�睵CR產(chǎn)物表達明顯增高;先予不同濃度的EM作用于16HBE 24 h或48 h后，再用TNF�拨链碳�16 h，與僅用TNF�拨链碳そM比較，各組16HBE ICAM��1 RT�睵CR產(chǎn)物表達均降低，且提示有濃度和時間依賴性。見圖1，表1。

1.Marker;2.對照組;3.TNF�拨�(20 ng/ml��16 h)刺激組;4.EM(0.3 μg/ml��24 h)+TNF�拨�(20 ng/ml��16 h);5.EM(3 μg/ml��24 h)+TNF�拨�(20 ng/ml��16 h);6.EM(30 μg/ml��24 h)+TNF�拨�(20 ng/ml��16 h);7.EM(0.3 μg/ml��48 h)+TNF�拨�(20 ng/ml��16 h);8.EM(3 μg/ml��48 h)+TNF�拨�(20 ng/ml��16 h);9.EM(30 μg/ml��48 h)+TNF�拨�(20 ng/ml��16 h)

2.2 RT�睵CR和克隆測序結(jié)果 ICAM��1 RT�睵CR產(chǎn)物分子大小約為700 bp，與原設(shè)計產(chǎn)物分子大小490 bp不相符，進一步作克隆測序了解基因之間是否具有同源性。將ICAM��1 PCR產(chǎn)物DNA序列與ICAM��1基因進行blast比較，具有高度同源性，顯示PCR產(chǎn)物即為目的基因：ICAM��1基因。見圖2。　表1 EM對ICAM��1 mRNA表達的影響

3 討 論

細胞間黏附分子1(ICAM��1)是細胞表面黏附分子，屬免疫球蛋白超家族，能與白細胞功能相關(guān)抗原��1(LFA��1)即(CD11a/CD18)結(jié)合發(fā)揮作用。主要分布在各種上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、單核巨噬細胞和淋巴細胞等，ICAM��1的生物學功能包括細胞黏附，細胞分化發(fā)育，參與抗原呈遞和T細胞活化，細胞介導的細胞毒作用，炎癥等多方面。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取16HBE細胞ICAM��1mRNA進行RT�睵CR，RT�睵CR產(chǎn)物DNA序列與ICAM��1基因具有高度同源性，顯示PCR產(chǎn)物即為目的基因：ICAM��1基因。但兩者之間存在差異，本實驗提示，不同種族、不同組織細胞ICAM��1基因表達可能具有一定差異性。

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