| 公開(公告)號 | CN1609231A |
| 公開(公告)日 | 2005.04.27 |
| 申請(專利)號 | CN03132205.0 |
| 申請日期 | 2003.10.22 |
| 專利名稱 | 中藥材gDNA種質(zhì)特異性微陣列芯片制備方法 |
| 主分類號 | C12Q1/68 |
| 分類號 | C12Q1/68 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 李同祥;王進(jìn)科;陸祖宏;南京新益華集團(tuán)有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 李同祥;王進(jìn)科;陸祖宏 |
| 地址 | 210096江蘇省南京市四牌樓2號東南大學(xué)分子與生物分子實驗室 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | |
| 代理人 | |
| 國省代碼 | 江蘇;32 |
| 主權(quán)項 | 中藥材gDNA種質(zhì)特異性微陣列芯片制備方法，其特征在于該制備方法包括如下步驟：(a)提取各樣本的gDNA，用識別4個堿基的平頭末端酶酶切，酶切產(chǎn)物為平頭末端，理論上每44即256個堿基就有一個酶切位點，其酶切片段大小在150-500bp之間。(b)通過抑制性差減雜交(SSH)對在一個樣本(設(shè)其為Tester即試驗者)中存在而在另一樣本(設(shè)其為Driver即軀趕者)中不存在的差異gDNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集。(c)PCR產(chǎn)物用T-vecter克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取白色重組子克隆，挑取的克隆轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)。取0.5μl培養(yǎng)菌液，用5′端修飾有氨基的nestedPCRprimer1(圖1(4))和nestedPCRprimer2(圖1(5))在96微孔板中擴(kuò)增差異克隆。(d)gDNA用識別4個堿基的平頭末端酶酶切后，連接接頭adaptor3，用引物primer3擴(kuò)增時摻入dCTP-Cy3或dCTP-Cy5進(jìn)行標(biāo)記的擴(kuò)增子其PCR產(chǎn)物直接用于雜交篩選。(e)將所有差異克隆用點樣儀點樣于硅烷化處理的玻片上，在一定條件下分別用熒光標(biāo)記的不同樣本擴(kuò)增子(amplicons)雜交，用激光掃描儀進(jìn)行掃描檢測，篩選獲取種質(zhì)特異性探針。(f)將獲得的所有種質(zhì)特異性探針制作成微陣列。 |
| 摘要 | 中藥材gDNA種質(zhì)特異性微陣列芯片制備方法是以名貴中藥材(石斛)為材料，提取其不同品種gDNA，用識別4個堿基的(如RsaI酶)酶切，酶切產(chǎn)物為平頭末端，通過抑制性差減雜交(SSH)，獲取不同種間差異克隆片段并點樣于玻片，采用dCTP-Cy3和dCTP-Cy5標(biāo)記的gDNA擴(kuò)增子與其雜交篩選到種質(zhì)特異性探針，以這些大量的探針制備成可用于平行檢別多個品種及真、偽的中藥種質(zhì)鑒定芯片。本發(fā)明以gDNA為鑒別的信息載體，在基因組(gDNA)水平上尋找獲得種質(zhì)特異性探針制備低成本、高通量、平行鑒別多種及真?zhèn)蔚闹兴幏N質(zhì)鑒定芯片。獲得的大量種質(zhì)特異性探針，對中藥的基因組特征研究及探索中藥的遺傳進(jìn)化和生物學(xué)分類提供大量的信息，對于建立中藥材種間、真?zhèn)舞b別系統(tǒng)基因庫標(biāo)準(zhǔn)基因圖譜具有非常重要的價值，同時，為道地藥材和非道地藥材質(zhì)量差異的研究，以及優(yōu)質(zhì)中藥材種質(zhì)的篩選和育種栽培研究提供技術(shù)支撐，對中藥的高通量鑒定，實現(xiàn)中藥質(zhì)量控制，促進(jìn)中藥現(xiàn)代化有廣泛的應(yīng)用價值。 |
| 國際公布 |
