| 公開(公告)號 | CN1580278A |
| 公開(公告)日 | 2005.02.16 |
| 申請(專利)號 | CN03132206.9 |
| 申請日期 | 2003.07.31 |
| 專利名稱 | NF－κB檢測雙鏈DNA微陣列芯片及制備 |
| 主分類號 | C12Q1/68 |
| 分類號 | C12Q1/68 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權 | |
| 申請(專利權)人 | 王進科;李同祥;陸祖宏;南京新益華集團有限公司 |
| 發(fā)明(設計)人 | 王進科;李同祥;陸祖宏 |
| 地址 | 210096江蘇省南京市文昌街2號八舍514室 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構 | |
| 代理人 | |
| 國省代碼 | 江蘇;32 |
| 主權項 | 一種檢測核因子-κB(NuclearFactor-κB，NF-κB)的雙鏈DNA微陣列芯片(double-strandedDNAmicroarraychip，dsDNAmicroarraychip)及其制備(Fabrication)方法，其特征在于該微陣列芯片具有如下結構、功能及制備特征：(a)NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片的結構特征：NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片由固相支持物及固定在固相支持物表面的dsDNA微陣列構成，該dsDNA微陣列由大量固定在固相支持物表面的dsDNA探針分子文庫(library)組成，文庫中不同的dsDNA探針分子上有DNA序列不同的NF-κB轉錄因子結合位點(DNA-bindingsites)。(b)NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片的功能特征：NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片可以依靠序列特異性DNA結合蛋白NF-κB轉錄因子與芯片dsDNA探針分子上NF-κB的DNA結合位點發(fā)生結合反應，實現(xiàn)對被檢測物中NF-κB蛋白的高通量檢測，發(fā)揮多項生物功能，包括：①確定特定細胞核抽提物或溶液中不同NF-κB/Re1家族蛋白包括Re1A/p65、Re1B、c-Re1、NF-κB1/p50和NF-κB2/p52的表達種類；②確定特定細胞核抽提物或溶液中不同NF-κB/Re1家族蛋白如Re1A/p65、Re1B、c-Re1、NF-κB1/p50和NF-κB2/p52的表達水平和活化程度；③確定不同NF-κB/Re1家族蛋白與大量突變型及野生型dsDNA靶點的相互作用的特異性與親合性特征；④確定NF-κB/Re1蛋白與大量突變型及野生型dsDNA靶點相互作用的堿基和氨基酸鍵合規(guī)律；⑤確定NF-κB/Re1蛋白dsDNA結合靶點的堿基組成矩陣(matrix)，預測新的NF-κB/Re1蛋白dsDNA結合靶點，并從全基因組DNA序列中搜索預測的新的NF-κB/Re1蛋白dsDNA結合靶點，尋找這些dsDNA結合靶點的上、下游基因，研究這些基因是否受到NF-κB/Re1蛋白的表達調控，從而鑒定新的NF-κB/Re1蛋白調控基因；⑥通過鑒定新的NF-κB/Re1蛋白調控基因，并結合已知的NF-κB/Re1蛋白調控基因，構建全基因組NF-κB/Re1蛋白基因表達調控網(wǎng)絡；⑦篩選NF-κB/Re1蛋白dsDNA靶點序列特異性結合組合化學分子及天然生物分子；⑧篩選NF-κB/Re1蛋白與dsDNA靶點相互作用干預性組合化學分子及天然生物分子。(c)NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片的制備方法：NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片的制備方法包括如下9種：①固相化學合成兩條堿基序列完全互補的寡核苷酸，其中寡核苷酸上嵌合NF-κB結合位點，通過液相復性成為雙分子(bimolecular)雙鏈寡核苷酸，再點樣連接固定到固相基質表面，形成NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片(雙分子寡核苷酸復性點樣法)；②固相化學合成兩條堿基序列完全互補的寡核苷酸，其中寡核苷酸上嵌合NF-κB結合位點，先將其中化學修飾的一條寡核苷酸點樣連接固定到固相基質表面，形成單鏈DNA微陣列芯片，再用互補的另一條寡核苷酸雜交復性成為雙分子(bimolecular)雙鏈寡核苷酸，形成NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片(雙分子寡核苷酸點樣復性法)；③固相化學合成兩條寡核苷酸，其中一條較長寡核苷酸上嵌合NF-κB結合位點，另一條較短的寡核苷酸作為通用引物，先將化學修飾的較長寡核苷酸點樣連接固定到固相基質表面，形成單鏈DNA微陣列芯片，再與通用引物寡核苷酸雜交復性成為部分雙分子(partialbimolecular)雙鏈寡核苷酸，再用DNA聚合酶進行在片延伸反應，使部分雙分子雙鏈寡核苷酸成為完整雙分子(completebimolecular)雙鏈寡核苷酸，形成NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片(雙分子寡核苷酸通用引物點樣復性延伸法)；④固相化學合成兩條寡核苷酸，其中一條較長寡核苷酸上嵌合NF-κB結合位點，另一條較短的寡核苷酸作為通用引物，先將化學修飾的較長寡核苷酸與通用引物寡核苷酸在液相雜交復性成為部分雙分子(partialbimolecular)雙鏈寡核苷酸，將復性產物點樣連接固定到固相基質表面，形成部分雙分子雙鏈寡核苷酸微陣列芯片，再用DNA聚合酶進行在片延伸反應，使部分雙分子雙鏈寡核苷酸成為完整雙分子(completebimolecular)雙鏈寡核苷酸，形成NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片(雙分子寡核苷酸通用引物復性點樣延伸法)；⑤固相化學合成兩條寡核苷酸，其中一條較長寡核苷酸上嵌合NF-κB結合位點，另一條較短的寡核苷酸作為通用引物，先將化學修飾的較長寡核苷酸與通用引物寡核苷酸在液相雜交復性成為部分雙分子(partialbimolecular)雙鏈寡核苷酸，再用DNA聚合酶進行延伸反應，使部分雙分子雙鏈寡核苷酸成為完整雙分子(completebimolecular)雙鏈寡核苷酸，將延伸產物點樣連接固定到固相基質表面，形成NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片(雙分子寡核苷酸通用引物復性延伸點樣法)；⑥合成一條長寡核苷酸，使寡核苷酸含有兩段鏈內反向互補序列，且反向互補序列內含有NF-κB結合位點，將復性寡核苷酸點樣連接固定到固相基質表面，形成寡核苷酸微陣列芯片，通過變性再復性成為單分子(unimolecular)雙鏈寡核苷酸微陣列芯片，形成NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片；此法也可以先在液相進行變性再復性，然后點樣連接固定到固相基質表面，形成寡核苷酸微陣列芯片(單分子鏈內互補法)；⑦合成一條較短的寡核苷酸，使寡核苷酸含有NF-κB結合位點，并且在其3′端(羥基)含有兩段鏈內反向互補 |
| 摘要 | 本發(fā)明在固相支持物(solid substrates)表面制備一種雙鏈脫氧核糖核酸(double-strandedDNA，dsDNA)微陣列(microarray)，使其dsDNA探針(probes)上嵌合核因子κB(nuclear factorκB，NF-κB)的序列特異性DNA結合位點(sequence-specific DNA-binding sites)，用以高通量檢測(high-throughput detecting)細胞核內NF-κB的含量及篩選dsDNA/NF-κB相互作用干擾性分子(molecules interfering dsDNA/NF-κB interaction)。本發(fā)明首先依靠專利技術(中國專利02112780.8及02137945.9)及其它本發(fā)明提出的方法，在固相支持物表面制備dsDNA微陣列，使該dsDNA微陣列上的大量dsDNA探針上含有NF-κB的序列特異性DNA結合位點，再將該dsDNA微陣列與特定細胞核蛋白或NF-κB純蛋白雜交結合，通過NF-κ、B與微陣列靶點dsDNA的相互作用，實現(xiàn)對特定細胞核中NF-κB蛋白的定性或定量測定，或通過檢測在外源分子，如組合化學分子、天然生物分子的存在下，NF-κB與微陣列靶點dsDNA相互作用特征的改變，篩選能夠干擾NF-κB與其靶點dsDNA的相互作用的分子，特別是能夠降低NF-κB與其靶點dsDNA結合親合性(binding affinity)的組合化學或天然生物小分子。本發(fā)明制備的NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片，在基礎分子生物學研究，特別是NF-κB相關基因表達調控和生物醫(yī)學研究，如NF-κB相關疾病藥物作用機理研究和藥物性分子篩選中有廣泛而重要的應用價值。 |
| 國際公布 |
