| 公開(公告)號 | CN1560081A |
| 公開(公告)日 | 2005.01.05 |
| 申請(專利)號 | CN200410021169.1 |
| 申請日期 | 2004.02.17 |
| 專利名稱 | 用能產生人IgGl重鏈－κ輕鏈小鼠作為制備人源化單克隆抗體和應用 |
| 主分類號 | C07K16/18 |
| 分類號 | C07K16/18;C12P21/08;C12N5/18 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權 | |
| 申請(專利權)人 | 大連帝恩生物工程有限公司 |
| 發(fā)明(設計)人 | 韓華;李元;李別虎;薛小平;黃慶生;王延竹;韓文君 |
| 地址 | 116600遼寧省大連市經濟技術開發(fā)區(qū)松嵐街17號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構 | 大連星海專利事務所 |
| 代理人 | 修德金 |
| 國省代碼 | 遼寧;21 |
| 主權項 | 用能產生人IgG1重鏈-κ輕鏈小鼠作為制備人源化單克隆抗體，包括：基因克隆、載體構建、轉化細胞、轉化小鼠、表達篩選、小鼠免疫、細胞融合、抗體制備，其特征在于：a)所采用的小鼠是在小鼠的Ig輕鏈κ恒定區(qū)基因和Ig重鏈g1恒定區(qū)基因位點上，分別敲入人的Igκ恒定區(qū)和IgG1恒定區(qū)基因，而培育產生人IgG1重鏈-κ輕鏈的小鼠；b)所制備的人源化單克隆抗體是，其抗體的恒定區(qū)與人抗體完全相同，而與抗原結合的可變區(qū)則是與小鼠抗體相同的人-鼠嵌合抗體；c)篩選表達具有人IgG1重鏈-κ輕鏈的嵌合抗體鼠；d)通過抗原免疫、細胞融合獲得可分泌人源化嵌合型單克隆抗體的雜交瘤細胞系；e)嵌合抗體的制備步驟是：第一步，從129sv小鼠的基因組DNA文庫中克隆小鼠的Igκ鏈和IgG1鏈基因組基因；第二步，基因敲入載體的構建輕鏈載體——將完整的人Igκ基因片段插入小鼠的Igκ基因位點，使得小鼠κ基因5’端的一小段編碼區(qū)被缺失，以在插入人κ基因的同時保證滅活小鼠κ基因，人κ基因下游插入正篩選基因neo(neomycinphosphotransferase)表達單位，在3’同源區(qū)下游插入負篩選基因白喉毒素A單位(DTA)表達單位，5’和3’同源區(qū)的大小分別為6kb和8kb；重鏈載體——在人分泌型IgG1基因的下游插入小鼠IgM的膜外顯子，再在下游插入正篩選基因表達單位，將構建的這一片段插入小鼠的IgM基因編碼區(qū)靠近5’端處，使得插入這一基因片段的同時完全滅活小鼠的IgM基因，同源區(qū)下游插入負篩選標志，5’和3’同源區(qū)的大小分別為5kb和7bk；第三步，在ES細胞中進行同源重組培養(yǎng)小鼠ES細胞系E14，用電穿孔法分別將構建的基因敲入載體轉染入ES細胞中，在G418存在下進行培養(yǎng)和篩選；第四步，嵌合小鼠的產生交配C57BL/6小鼠，在交配后4.5天時從妊娠的小鼠子宮收集囊胚，將同源重組的ES細胞通過顯微注射，注射入C57BL/6小鼠的囊胚腔中，再將囊胚移植到假孕的ICR小鼠的子宮中，出生的小鼠根據眼的顏色和毛色判斷嵌合程度；第五步，將輕鏈小鼠與重鏈小鼠進一步交配，得到輕鏈和重鏈基因位點上都是敲入的基因的小鼠；第六步，人源化單克隆抗體的制備。 |
| 摘要 | 生物工程領域中，用能產生人IgG1重鏈-κ輕鏈的小鼠作為制備人源化單克隆抗體和應用。特征：在小鼠輕鏈κ恒定區(qū)和重鏈g1恒定區(qū)基因位點上分別敲入人κ鏈和g1恒定區(qū)基因；用該小鼠制備的人源化單克隆抗體是抗體的恒定區(qū)與人抗體完全相同，而可變區(qū)為鼠源，制備步驟：小鼠κ鏈和g1鏈基因組的獲得；敲入載體的構建；在ES細胞中進行同源重組；輕、重鏈轉化小鼠的產生；輕、重鏈小鼠進一步交配，得到完整嵌合基因的小鼠；應用：取抗原免疫嵌合小鼠的脾臟與骨髓細胞進行融合、培養(yǎng)；篩選產生抗原特異性的人源化單克隆抗體的雜交瘤；制備抗原特異性的人源化單克隆抗體。優(yōu)點：技術操作簡便；重組正確率高；不影響抗體表達時可變區(qū)的基因重排模式，易獲得高親和力的人-鼠嵌合抗體。 |
| 國際公布 |
