| 公開(公告)號 | CN1132844C |
| 公開(公告)日 | 2003.12.31 |
| 申請(專利)號 | CN98103307.5 |
| 申請日期 | 1998.07.24 |
| 專利名稱 | 重組人白細胞介素—18的工程菌直至產(chǎn)物的制備方法 |
| 主分類號 | C07K14/54 |
| 分類號 | C07K14/54;C12N1/21;//C12N1/21,C12R1:19 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 吳光耀 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 吳光耀;劉祚昌 |
| 地址 | 100091北京市圓明園西路北京大學(xué)燕北園303樓406號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | 北京北新智誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 |
| 代理人 | 郭佩蘭 |
| 國省代碼 | 北京;11 |
| 主權(quán)項 | 一種重組人白細胞介素-18(IL-18)工程菌直至產(chǎn)物的制備方法，其特征在于它包括以下幾個步驟：①人外周血中白細胞的分離；②白細胞中總mRNA的分離；③人工合成含有限制性內(nèi)切酶切點的引物，在合成的上游引物中導(dǎo)入EcoRI位點，在合成的下游引物中導(dǎo)入BamHI位點，其引物的序列為：PL5′CG GAATTC AAA ATG TAC TTT GGC AAG CTT GAA 3′PR3′GC GGATCC TTA GTC TTC GTT TTG AAC AG 5′④RT-PCR基因擴增：在含有合成引物的存在下，以mRNA為模板，通過RT-PCR基因擴增，獲得IL-18基因片段，其核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列為：10ATG TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGAM Y F G K L E S K L S V I R20AAT TTG AAT GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGGN L N D Q V L F I D Q G N R30 40CCT CTA TTT GAA GAT ATG ACT GAT TCT GAC TGT AGA GAT AATP L F E D M T D S D C R D N50GCA CCC CGG ACC ATA TTT ATT ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGCA P R T I F I I S M Y K D S60 70CAG CCT AGA GGT ATG GCT GTA ACT ATC TCT GTG AAG TGT GAGQ P R G M A V T I S V K C E80AAA ATT TCA ACT CTC TCC TGT GAG AAC AAA ATT ATT TCC TTTK I S T L S C E N K I I S F90AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA AGTK E M N P P D N I K D T K S100 110GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AATD I I F F Q R S V P G H D N120AAG ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT CTAK M Q F E S S S Y E G Y F L130 140GCT TGT GAA AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAAA C E K E R D L F K L I L K150AAA GAG GAT GAA TTG GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTTK E D E L G D R S I M F T V158CAA AAC GAA GAC TAAQ N E D *⑤IL-18cDNA克隆和大腸桿菌轉(zhuǎn)化：經(jīng)EcoRI和BamHI酶切的pBV220載體和IL-18cDNA連接，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的大腸桿菌中，經(jīng)抗性培養(yǎng)基篩選，得陽性克隆的大腸桿菌，即IL-18工程菌。⑥將工程菌擴增培養(yǎng)，熱激表達、破壁、破包含體；IL-18純化。 |
| 摘要 | 一種重組人白細胞介素-18(IL-18)的工程菌及其產(chǎn)物的制備方法，包括人白細胞分離，白細胞總mRNA分離；人工合成含有限制性內(nèi)切酶切點的引物；RT-PCR基因擴增；IL-18 cDNA克��；轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌；工程菌中產(chǎn)物高效表達；IL-18的純化。由于采用含有限制性內(nèi)切酶切點的引物，準確獲得含有474個核苷酸的IL-18基因。使用大腸桿菌偏愛的終止密碼子提高表達率、采用高擴增培養(yǎng)基，表達量高，使得一步純化即可獲得醫(yī)用針劑純的產(chǎn)品。 |
| 國際公布 |
