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內(nèi)源基因超量表達(dá)技術(shù)提高黃芪甲苷含量

公開(公告)號 CN1314804C  
公開(公告)日 2007.05.09  
申請(專利)號 CN200510026025.X  
申請日期 2005.05.20  
專利名稱 內(nèi)源基因超量表達(dá)技術(shù)提高黃芪甲苷含量  
主分類號 C12N15/09(2006.01)I  
分類號 C12N15/09(2006.01)I;C12N15/10(2006.01)I;C12N15/54(2006.01)I;C12N15/63(2006.01)I;C12N15/87(2006.01)I;C12N15/82(2006.01)I;C12N5/04(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I;C12N15/74(2006.01)I;A01H4/00(2006.01)I;A61K36/481(2006.01)I;A61P9/10(2006.01)I  
分案原申請?zhí)?  
優(yōu)先權(quán)  
申請(專利權(quán))人 上海中醫(yī)藥大學(xué)  
發(fā)明(設(shè)計)人 杜 旻;胡之璧;劉 滌;周吉燕;王子艷;倪躍元  
地址 201203上海市浦東新區(qū)蔡倫路1200號  
頒證日  
國際申請  
進(jìn)入國家日期  
專利代理機(jī)構(gòu) 上海新天專利代理有限公司  
代理人 王 巍  
國省代碼 上海;31  
主權(quán)項 一種內(nèi)源基因超量表達(dá)技術(shù)提高黃芪甲苷含量的方法,其特征在于:包括下列步驟:1)總核糖核酸提。悍磻(yīng)試劑的配制:變性液26mM檸檬酸鈉pH 4.0,0.5%十二烷基肌氨酸鈉,0.125M 2-巰基乙醇,4M異硫氰酸胍;NaAc2M,pH 4.7;酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1;70%乙醇;所有的試劑皆用0.1%焦碳酸二乙酯水處理過的無核糖核酸酶水配制,玻璃容器皆去核糖核酸酶;操作程序:取適量新鮮植物組織置于陶瓷研缽中,加入液氮快速研磨至細(xì)粉末,轉(zhuǎn)移至含有650μl變性液的1.5ml離心管中混勻;加入65μl 2M NaAc pH 4.0,反復(fù)顛倒混勻;再加入650μl酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1,混勻,冰浴15min;4℃,12000rpm,離心20min;上清轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml離心管中,加等體積異丙醇,混勻后-20℃置30min;4℃,12000rpm,離心10min沉淀核糖核酸;棄上清液,將核糖核酸溶于0.5ml變性液中,65℃加熱盡快溶解;加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇,混合溶液重新抽提1次,即重復(fù)前步驟;離心后,棄上清液,加75%預(yù)冷乙醇1ml,漂洗沉淀,離心同上,棄上清;空氣干燥后,加20μl無菌雙蒸去離子水溶解核糖核酸,分光光度法和凝膠電泳檢測濃度和純度,余下部分-20℃保存?zhèn)溆茫?)逆轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)脫氧核糖核酸寡聚脫氧胸苷酸37.5μM 2μl,總核糖核酸10μg,無菌雙蒸去離子水10.5μl,70℃反應(yīng)10min,立即置冰上,5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μl,核糖核酸酶抑制劑40U/μl 0.5μl,10mM脫氧核酸核苷三磷酸1μl,逆轉(zhuǎn)錄酶200U/μl 1μl,42℃反應(yīng)1.5h,70℃反應(yīng)10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶;3)引物設(shè)計根據(jù)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因和腺苷二磷酸葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的互補(bǔ)脫氧核糖核酸序列設(shè)計引物P2:5’-tcgagccttacaggtcctttgg-3’,PxbaI:5’-tttctaatggccaccgctactgc-3’P20:5’-cctctagatgttgctcttactgctctctc-3’,P21:5’-ccgagctctgtggctcaaaatccttctg-3’構(gòu)建雙基因載體時擴(kuò)增引物為:Psf:5’-cagaagtactattccagtatgacg-3’,Psr:5’-tttcatgatctagtaacatagtgacac-3’4)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增互補(bǔ)脫氧核糖核酸1μl,引物15μM 2μl,引物25μM 2μl,10×緩沖液2μl,MgCl2 25mM1.6μl,脫氧核酸核苷三磷酸10mM 0.5μl,脫氧核糖核酸聚合酶3U/μl 0.3μl,無菌雙蒸去離子水94℃變性5min→94℃變性0.5min→60℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→30個循環(huán)→72℃延伸7min;5)連接pGEM-T載體:T4脫氧核酸緩沖液10×1μl,pGEM easy載體50ng/μl 1μl,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)純化產(chǎn)物適量,T4脫氧核酸連接酶3U/μl 1μl,無菌雙蒸去離子水,將反應(yīng)液混勻后4℃放置;6)感受態(tài)細(xì)菌的制備:從-70℃低溫冰箱取出菌種DH5α,接種于LB平板,37℃培養(yǎng)過夜進(jìn)行活化,從活化平皿上挑取單菌落,接入5ml不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振搖培養(yǎng)過夜250rpm,次日按1%V/V比例轉(zhuǎn)入新鮮的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振搖培養(yǎng)至OD600=0.3~0.6也可,在無菌條件下,將50~100ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入兩個預(yù)冷的無菌離心管中,冰上靜置10min,4℃,4000rpm離心10min,棄去上清液,倒置流盡培養(yǎng)液,加10ml預(yù)冷的0.1M CaCl2溶液,重懸浮細(xì)菌,冰浴30min,4℃,4000rpm離心10min,棄去上清液,加2ml預(yù)冷的0.1M CaCl2溶液,重懸浮細(xì)菌,即為感受態(tài)細(xì)胞;7)轉(zhuǎn)化與克隆篩選在制得的感受態(tài)細(xì)胞中加4μl載體連接質(zhì)粒脫氧核酸,冰浴30min后,于42℃熱激1.5min,冰上冷卻1~2min;加入SOC培養(yǎng)基800μl,于37℃,180rpm搖床培養(yǎng)1hr;取培養(yǎng)物100μl鋪LB平板加相應(yīng)的篩選抗生素,再加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷,5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷各5μl,37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng),根據(jù)藍(lán)白斑篩選陽性克;8)分別以引物對腺苷二磷酸葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因特征引物P20-P21、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因特征引物Pxbai-P2擴(kuò)增腺苷二磷酸葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因模板1μl,引物15μM 2μl,引物5μM 2μl,10×緩沖液2μl,MgCl225mM 1.6μl,脫氧核酸核苷三磷酸10mM 0.5μl,脫氧核糖核酸聚合酶3U/μl 0.3μl,無菌雙蒸去離子水94℃變性5min→94℃變性0.5min→45℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→3個循環(huán)→94℃變性0.5min→55℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→27個循環(huán)→72℃延伸7min,測序;9)雙酶切:10×雙酶切緩沖液10μl,限制性核酸內(nèi)切酶XbaI 10U/μl 3μl,限制性核酸內(nèi)切酶SacI 10U/μl 3μl,脫氧核糖核酸10μg,無菌雙蒸去離子水37℃水浴1hr,取出75℃滅活內(nèi)切酶,取5μl電泳鑒定,其余部分酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1純化后,加1/10體積的3M NaAc,2體積的乙醇沉淀脫氧核糖核酸,靜置10min后,12000rpm,4℃,離心10min,沉淀用70%乙醇洗滌兩次后晾干約10min,加適量的無菌水溶解,進(jìn)行與載體的連接或者-20℃保存待用;10)質(zhì)粒pBI121的提取、雙酶切反應(yīng)試劑的配制:LB液體培養(yǎng)基;溶液150mM葡萄糖,25mM Tris-HCl,10mM乙二胺四乙酸,pH 8.0;溶液20.2M NaOH,1%十二烷基硫酸鈉;溶液35M KAc 60ml,HAc 11.5ml,無菌雙蒸去離子水28.5ml;酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1混合液;核糖核酸酶  
摘要 本發(fā)明公開了一種內(nèi)源基因超量表達(dá)技術(shù)提高黃芪甲苷含量的方法。本發(fā)明將多糖代謝途徑的兩個代謝反應(yīng)偶連的關(guān)鍵酶基因ugp基因(尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因)和gbss基因(腺苷二磷酸葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因),經(jīng)體外修飾,增加強(qiáng)化表達(dá)的調(diào)控元件,構(gòu)建成功中間載體,通過電穿孔法將表達(dá)中間載體pBI-UG轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌LBA-9402,獲得轉(zhuǎn)多糖合成雙基因的黃芪毛狀根。其中黃芪甲苷的含量比未轉(zhuǎn)基因的黃芪毛狀根高6倍。  
國際公布  
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