羅非魚病原菌的分離鑒定及藥敏特性分析
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細(xì)菌病暴發(fā)是造成羅非魚經(jīng)濟(jì)損失的重要原因之一，而嗜水氣單胞菌作為主要的病原菌之一，其發(fā)病率及耐藥性也逐年增加。近年來(lái)，大量資料證明，嗜水氣單胞菌可引發(fā)人類的食物中毒、
敗血癥、
腦膜炎、蜂窩組織炎及傷口感染，影響食物安全，是重要的“人-獸-魚”共患病病原菌。去年4月，在廣東廣州一養(yǎng)殖場(chǎng)患病尼羅羅非魚病灶處曾分離出一株細(xì)菌，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢、ATB生化鑒定以及16SrRNA基因序列分析，確定分離株為嗜水氣單胞菌，并經(jīng)過(guò)了相關(guān)藥敏抗性試驗(yàn)檢測(cè)，為該病害的預(yù)防提供參考。材料與方法病魚來(lái)源 發(fā)病羅非魚樣本采自廣州一羅非魚養(yǎng)殖場(chǎng)，體重250克~300克。病原菌的分離與培養(yǎng) 現(xiàn)場(chǎng)取發(fā)病羅非魚，由羅非魚的表面癥狀可知，其眼部凹陷，鰓部充血嚴(yán)重；解剖發(fā)現(xiàn)腸道無(wú)食、紅腫、黏液增多，肝部有病變，有斑點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌操作臺(tái)上用75%酒精棉球?qū)Σ蓸郁~體表進(jìn)行消毒，無(wú)菌取樣器取病魚的肝、腦、腎、腸組織及眼部，劃線接種于血瓊脂平板和TSA平板。28℃培養(yǎng)18小時(shí)后，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，純化后的細(xì)菌用于生化分子鑒定及藥敏檢測(cè)。結(jié)果細(xì)菌的分離培養(yǎng)及染色鏡檢 不同組織分離到的菌落形態(tài)基本一致。在TSA平板上28℃條件下培養(yǎng)24小時(shí)，呈圓形、邊緣整齊、中央隆起、表面濕潤(rùn)、光滑、顏色淺黃的菌落。在血平板上呈典型的β溶血環(huán)。經(jīng)革蘭氏染色，在油鏡下均為革蘭氏陰性桿菌，兩端鈍圓，直或略彎，單個(gè)或成雙排列，無(wú)莢膜。生理生化結(jié)果 對(duì)分離菌株與標(biāo)準(zhǔn)的嗜水氣單胞菌同時(shí)用生化分析儀進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，病原菌的生理生化反應(yīng)指征與嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的結(jié)果一致，所以分離到的菌株應(yīng)為嗜水氣單胞菌。分子鑒定 采用大腸桿菌、羅非魚
無(wú)乳鏈球菌和嗜水氣單胞菌三個(gè)菌的PCR引物同時(shí)對(duì)病原菌進(jìn)行擴(kuò)增，并設(shè)陰性對(duì)照，結(jié)果，菌株經(jīng)擴(kuò)增得到大小為420bp左右的特異性條帶，與嗜水氣單胞菌的特異性條帶一致，此鑒定結(jié)果也與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致。藥敏試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)15種比較常規(guī)的抗生素進(jìn)行抗性試驗(yàn)（表2)，菌株對(duì)菌必治、
環(huán)丙沙星、
氧氟沙星、
四環(huán)素以及恩諾沙星表現(xiàn)極敏感，對(duì)
頭孢氨芐、
新霉素、氟苯尼考、
阿莫西林、
妥布霉素、卡那霉素和羅
紅霉素較敏感，對(duì)
鏈霉素、
青霉素、新生霉素不敏感。討論由于發(fā)病魚的表觀主要臨床癥狀之一為眼球突出，且有臨死前于水面打轉(zhuǎn)或間歇性竄游的表現(xiàn)，因此也懷疑為鏈球菌病，革蘭氏染色鏡檢也發(fā)現(xiàn)一種陽(yáng)性球菌，經(jīng)PCR鑒定為海豚鏈球菌。在致病性研究中也一起進(jìn)行了攻毒試驗(yàn)，結(jié)果10尾魚中僅有2尾死亡，說(shuō)明該球菌的致病力比較弱，這說(shuō)明嗜水氣單胞菌是導(dǎo)致此次尼羅羅非魚發(fā)病的主要致病菌，但臨床感染中這種混合感染的情況值得關(guān)注和防范。嗜水氣單胞菌廣泛存在于水、土壤以及水生動(dòng)物中，是條件性致病菌。本次網(wǎng)箱尼羅羅非魚的發(fā)病即是由于轉(zhuǎn)群引起，轉(zhuǎn)入網(wǎng)箱前魚體表現(xiàn)正常，無(wú)死魚，轉(zhuǎn)入網(wǎng)箱后開始發(fā)病，連續(xù)一周內(nèi)，每天均有四五十尾魚死亡。細(xì)菌分離鑒定后進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)菌必治、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、四環(huán)素以及恩諾沙星表現(xiàn)極敏感，對(duì)頭孢氨芐、新霉素、氟苯尼考、阿莫西林、妥布霉素、卡那霉素和
羅紅霉素較敏感，對(duì)鏈霉素、青霉素、新生霉素不敏感。這一結(jié)果與以往的報(bào)道有較大差異，蔡完其等在發(fā)病羅非魚的溫和氣單胞菌的病原研究和藥敏試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，丁胺卡那霉素對(duì)分離到的嗜水氣單胞菌具有很好地抑菌效果，而對(duì)本研究中分離到的菌株卻不敏感；董忠典等的研究發(fā)現(xiàn)，分離到的4株菌對(duì)丁胺卡那、鏈霉素極為敏感，對(duì)頭孢噻吩不敏感，而本次分離到的菌株對(duì)頭孢噻吩敏感，對(duì)丁胺卡那、鏈霉素不敏感。這可能與不同地區(qū)的用藥情況有關(guān)，但隨著各種藥物耐藥程度的不斷升高，建議臨床以加強(qiáng)管理，預(yù)防發(fā)病為主，用藥時(shí)盡量采用輪換用藥，避免一種藥物長(zhǎng)期應(yīng)用，或是采用有好的抑菌效果的中藥制劑。隨著人們對(duì)魚類健康養(yǎng)殖的需求日益增加，使用疫苗預(yù)防各種水產(chǎn)疾病的發(fā)生是目前研究的重點(diǎn)，然而疫苗菌株的選擇及合適的劑型是目前研究需要解決的重要問(wèn)題，魚類免疫不同于其他動(dòng)物，通過(guò)腹腔注射進(jìn)行免疫會(huì)耗費(fèi)大量的人力物力，很難應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，因此開發(fā)浸泡和口服疫苗是適用水產(chǎn)動(dòng)物的最佳途徑。本研究分離到一株具有強(qiáng)致病性的嗜水氣單胞菌，目前僅對(duì)其生化特性、藥物敏感性和致病力進(jìn)行了初步探索，菌株的傳代毒力、半數(shù)致死量及免疫原性等仍需進(jìn)一步研究，但就其應(yīng)用前景來(lái)說(shuō)，可以為嗜水氣單胞菌的疫苗開發(fā)奠定基礎(chǔ)，提供合適的候選菌株。黃木珍潘忠超石和榮點(diǎn)擊了解最新水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)
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