氟苯尼考聯(lián)合用藥對(duì)產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌抗菌活性的
-----
超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)是由質(zhì)粒介導(dǎo)、主 要由大腸埃希菌和
肺炎克雷伯菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶，能水解
青霉素類(lèi)，第1代、第2代、第3代和部分第4代頭孢菌素及
氨曲南，可在菌株間轉(zhuǎn)移或傳播[1,2]。近年來(lái)，第3代頭孢菌素的廣泛應(yīng)用使產(chǎn)ESBLs的細(xì)菌不斷增加，已成為獸醫(yī)臨床感染的重要病原菌。值得注意的是，產(chǎn)ESBLs菌株不僅對(duì)β-內(nèi)酰胺抗生素耐藥，并且也對(duì)氟喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、
氯霉素類(lèi)、
四環(huán)素類(lèi)等多種抗菌藥產(chǎn)生耐藥性，這就為動(dòng)物細(xì)菌病的治療提出了新的挑戰(zhàn)。氟苯尼考是氯霉素類(lèi)獸用廣譜抗生素，主要用于治療畜禽及魚(yú)類(lèi)的細(xì)菌性疾病，隨著在獸醫(yī)臨床上的廣泛使用，畜禽的致病菌尤其是產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌的耐藥現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重[3,4]。因此，尋找合理的聯(lián)合用藥已成為控制耐藥菌尤其是產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌感染亟待解決的問(wèn)題。鑒此，就氟苯尼考與幾種抗菌藥的聯(lián)合用藥進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，從而為氟苯尼考復(fù)方制劑的研制及臨床合理配伍用藥控制產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌感染提供依據(jù)。1 材料和方法1．1 材料1．1．1 受試菌株 質(zhì)控菌株：大腸埃希菌硼ATCC25922，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品鑒定所；臨床菌株：7株受試大腸桿菌均從山東病
雞肝臟中分離，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室保存。1．1．2 藥物和藥敏紙片 氟苯尼考原粉(95%)、黏菌素(90%)、頭孢噻呋(95%)、痢菌凈(98%)、
磷霉素鈉(65%)、
多西環(huán)素(95%)、
阿米卡星(65%)，均由河南牧翔動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供；
頭孢噻肟(30μg/片)、
頭孢曲松(30μg/片)、氨曲南(30μg/片)、
頭孢他啶(30μg/片)、頭孢噻肟/克拉維酸(30/1Oμg每片)、頭孢他啶/克拉維酸(30/10μg每片)由北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司提供。1．1．3 培養(yǎng)基、試劑 血平板瓊脂(鄭州安圖生物技術(shù)有限公司)、麥康凱瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、M -H 瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、M -H 肉湯(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)、G-N增菌液(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)、革蘭氏染色液(鄭州理利生物工程有限公司)。1．1．4 儀器 SW -CJ-JC型超凈工作臺(tái)、Pyx-DHx型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、手提式壓力蒸汽滅菌器、DZF一6050型真空干燥箱、全自動(dòng)電子分析天平、新飛電冰箱等。1．2 方法1．2．1 菌液制備 將經(jīng)過(guò)鑒定的雞大腸桿菌分離株接種于麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)16～18h，挑選單個(gè)菌落接種于G-N 增菌液中37℃過(guò)夜培養(yǎng)，使菌液濃度相當(dāng)于108cfu／mL。試驗(yàn)時(shí)稀釋1000倍，使稀釋后的菌液濃度為105cfu/mL[5,6]。1．2．2 藥物原液的配制[5,6] 用分析天平精確稱(chēng)取適量藥物后，無(wú)菌操作使其溶于適宜的溶劑，置4℃ 冰箱中保存?zhèn)溆�，配制藥�?周內(nèi)用完。1．2．3 ESBLs表型篩選 采用美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI，M100-S16)推薦的方法，將增菌培養(yǎng)的菌液均勻涂布于M -H 瓊脂上，按照標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法的規(guī)定進(jìn)行，于平板上分別貼上頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、氨曲南藥敏片，37℃ 過(guò)夜培養(yǎng)之后，如抑菌圈直徑滿(mǎn)足以下任一條件即可懷疑其為產(chǎn)ESBLs菌株：頭孢噻肟≤ 27mm，頭孢他啶≤22mm，頭孢曲松≤25mm，氨曲南≤27mm。1．2．4 ESBLs的確認(rèn)試驗(yàn)(雙紙片增效法)[7] 采用美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI，M100-S16)推薦的方法，將疑似產(chǎn)酶的增菌培養(yǎng)的菌液均勻涂布于M -H瓊脂板上，將頭孢噻肟、頭孢噻肟／克拉維酸、頭孢他啶、頭孢他啶／克拉維酸藥敏片兩兩對(duì)應(yīng)，分別貼在同一個(gè)M -H 瓊脂板上，37℃ 過(guò)夜孵育之后，當(dāng)2組藥物有任意1組出現(xiàn)加克拉維酸比不加克拉維酸的抑菌圈直徑≥5mm時(shí)，即確認(rèn)為產(chǎn)ESBLs。1．2．5 藥敏試驗(yàn)用微量液體2倍稀釋法，分別測(cè)定氟苯尼考單方藥物和復(fù)方藥物對(duì)7株大腸桿菌的最小抑菌濃度。試驗(yàn)中，菌液濃度應(yīng)為105cfu/mL，置于37℃ 恒溫培養(yǎng)箱中，18～24h后觀察結(jié)果，能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最小藥物濃度為MIC。2 結(jié)果與分析2．1 ESBLs的表型篩選試驗(yàn)及確認(rèn)試驗(yàn)中抑菌圈直徑大小雞大腸桿菌ESBLs的表型篩選、確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表1、表2。從表1可以看出，頭孢噻肟的抑菌圈直徑≤27mm 的菌有6株，頭孢他啶的抑菌圈直徑≤22mm 的菌有7株，頭孢曲松的抑菌圈直徑≤25mm的菌有5株，氨曲南的抑菌圈直徑≤27mm 的菌有6株，故7株菌均可能產(chǎn)ESBLs。從表2可以看出，7株可疑產(chǎn)ESBLs菌株經(jīng)確認(rèn)試驗(yàn)檢測(cè)，藥物中加克拉維酸后，抑菌圈直徑明顯增大。其中有6株菌出現(xiàn)頭孢噻肟/克拉維酸的抑菌圈直徑比頭孢噻肟大5mm，有5株菌出現(xiàn)頭孢他啶/克拉維酸的抑菌圈直徑比頭孢他啶大于等于5mm。7株可疑產(chǎn)ESBLs菌株均為產(chǎn)ESBLs的陽(yáng)性菌株。2．2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果單藥和復(fù)方藥物對(duì)7株臨床分離的產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌的MIC值見(jiàn)表3。從表3可看出，7株大腸桿菌對(duì)多肽類(lèi)黏菌素顯示高度敏感，而對(duì)頭孢菌素類(lèi)頭孢噻呋耐藥率達(dá)100%，對(duì)氨基糖苷類(lèi)阿米卡星耐藥率達(dá)71%，對(duì)四環(huán)素類(lèi)多西環(huán)素耐藥率達(dá)57%，對(duì)喹啉類(lèi)痢菌凈耐藥率達(dá)100%，對(duì)磷霉素耐藥率達(dá)57%。說(shuō)明這7株產(chǎn)ESBLs菌不但對(duì)β-內(nèi)酰胺抗生素耐藥，而且顯示較高的多重耐藥特性。氟苯尼考與黏菌素復(fù)配時(shí)，雖說(shuō)以氟苯尼考計(jì)抗菌活性顯著增強(qiáng)，但是由于單藥黏菌素對(duì)7株產(chǎn)酶菌抗菌活性均較強(qiáng)，氟苯尼考與黏菌素(1：1)復(fù)配時(shí)的MIC與單藥黏菌素的MIC幾乎一樣，氟苯尼考與黏菌素(1：2)復(fù)配時(shí)，可能是黏菌素的用量加倍的緣故，MIC值普遍降低，由此看出，黏菌素單藥使用時(shí)就可抑制本試驗(yàn)中的7株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌。氟苯尼考與頭孢噻呋復(fù)配，3個(gè)比例均沒(méi)能使抗菌活性增強(qiáng)。氟苯尼考與阿米卡星3個(gè)比例復(fù)配時(shí)，43 的菌株抗菌活性有所提高，其中以1：2的比例復(fù)配時(shí)MIC值下降程度最大。氟苯尼考與多西環(huán)素3個(gè)比例復(fù)配時(shí)，7株菌的MIC值在不同比例下均有不同程度的下降，尤其以1：2比例復(fù)配時(shí)下降幅度最大。氟苯尼考與痢菌凈只有1：2比例復(fù)配時(shí)，57 的菌株MIC值呈現(xiàn)較小程度下降。氟苯尼考與磷霉素聯(lián)合用藥時(shí)，只有2株菌在1：1和1：2的比例復(fù)配時(shí)MIC有所降低。3 討論1)本試驗(yàn)中分離的7株雞大腸桿菌，經(jīng)檢測(cè)均產(chǎn)ESBLs，100%的高檢出率，說(shuō)明產(chǎn)ESBLs菌株呈直線(xiàn)上升趨勢(shì)。近年來(lái)，隨著第3代動(dòng)物專(zhuān)用廣譜頭孢菌素在雞病防治中的廣泛應(yīng)用以及第3代醫(yī)用頭孢的濫用，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥現(xiàn)象相當(dāng)嚴(yán)重，給臨床治療造成較大的困難。這些耐藥菌絕大多數(shù)產(chǎn)ESBLs，自1983年德國(guó)首次發(fā)現(xiàn)此酶以來(lái)，與之相關(guān)的國(guó)內(nèi)外報(bào)道日益增多，產(chǎn)ESBLs菌的種類(lèi)也越來(lái)越多，逐漸引起關(guān)注。2)分離出的7株產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌，不僅對(duì)頭孢噻呋100%耐藥，而且對(duì)氯霉素類(lèi)氟苯尼考100%耐藥，對(duì)氨基糖苷類(lèi)阿米卡星71 耐藥，對(duì)四環(huán)素類(lèi)多西環(huán)素57%耐藥，對(duì)喹啉類(lèi)痢菌凈100％耐藥，對(duì)磷霉素57%耐藥。由此可以看出，產(chǎn)ES-BLs菌株不僅對(duì)β-內(nèi)酰胺酶抗生素耐藥，而且呈現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象。這與胡功政等[7] 相關(guān)報(bào)道一致。菌株產(chǎn)酶使藥物失活是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制之一，產(chǎn)ESBLs菌株，能夠使青霉素或頭孢菌素的β-內(nèi)酰胺環(huán)斷裂而使β-內(nèi)酰胺藥物失效。但產(chǎn)酶菌同時(shí)對(duì)多種藥物產(chǎn)生的多重耐藥性機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。3)氟苯尼考屬動(dòng)物專(zhuān)用的廣譜抗生素，為氯霉素的結(jié)構(gòu)同系物，其作用機(jī)理及抗菌譜與氯霉素和甲砜霉素相似，氯霉素有嚴(yán)重的致
再生障礙性貧血的不良反應(yīng)，而氟苯尼考彌補(bǔ)了此種不足。因此，在動(dòng)物疾病防治上，氟苯尼考替代了氯霉素，在獸醫(yī)臨床發(fā)揮著重要的作用[8,9]。近年來(lái)，由于抗菌藥物的濫用，致使大量耐藥菌株產(chǎn)生，氟苯尼考的抗菌作用也逐漸降低，人們不得不去尋找新的解決辦法。結(jié)合本次試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，氟苯尼考與6種藥物聯(lián)合用藥時(shí)，與頭孢噻呋復(fù)配完全無(wú)效，這與理論上是相符的，頭孢噻呋是I類(lèi)速效殺菌劑抗菌藥，氟苯尼考是Ⅲ類(lèi)速效抑菌劑，I類(lèi)和Ⅲ類(lèi)合用時(shí)Ⅲ類(lèi)藥物可迅速阻斷細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成，致細(xì)菌基本處于靜止?fàn)顟B(tài)，因此，和I類(lèi)合用時(shí)有導(dǎo)致后者活性減弱的可能，二者不宜合用。而其他幾類(lèi)藥均能使一部分菌株的抗菌活性有所提高，均以1：2效果最佳，其中以氟苯尼考與多西環(huán)素1：2配伍，7株菌的MlC值下降幅度最大，6種聯(lián)合用藥中這一組合最好，這與苑麗等[10]報(bào)道的相一致。原本對(duì)氟苯尼考耐藥的產(chǎn)ESBLs菌株在聯(lián)合用藥以后，抗菌活性明顯提高，從而可以看出，聯(lián)合用藥是一個(gè)控制產(chǎn)ESBLs菌感染的有效途徑。
畜牧導(dǎo)航:
養(yǎng)雞資訊 雞價(jià)格行情 養(yǎng)雞技術(shù) 雞病防治 飼養(yǎng)管理 養(yǎng)雞問(wèn)答
