以質(zhì)�；蚴删w作載體進(jìn)行DNA克隆，在理論上是很簡(jiǎn)捷的，即用一種限制酶切割質(zhì)粒DNA，然后在體外與外源，DNA（如干擾素基因，生長(zhǎng)激素基因)相連接，再用所得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌如大腸桿菌，以鑒定重組DNA。
通常所用的質(zhì)粒載體有pBR322、pUC18、pUC19等，噬菌載體有M13噬菌體載體等。
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圖24-1 質(zhì)粒載體的定向克隆
外源DNA片段末端的性質(zhì)，以及質(zhì)粒載體和外源DNA上限制酶切位點(diǎn)的性質(zhì)決定了質(zhì)�；蚴删w與外源DNA連接反應(yīng)的不同策略。
（一)外源DNA帶有非互補(bǔ)突出端的片段
用兩種不同的限制酶分別消化質(zhì)粒等載體和外源DNA，可以產(chǎn)生帶非互補(bǔ)突出端的片段，這是最容易連接的片段，如圖24-1所示。
將已經(jīng)連接外源DNA的細(xì)菌質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌，然后在含有AP等抗生素的平板上鑒定陽(yáng)性重組體菌落，具體方法有：①檢查α互補(bǔ)能力的喪失情況；②對(duì)小量制備的質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶切的分析；③核酸雜交。
（二)外源DNA帶有相同末端（平端或粘端)的片段
帶有相同末端（平端或粘端)的外源DNA片段必須克隆到具有匹配末端的線狀質(zhì)�；蚴删w載體中，在連接反應(yīng)中，質(zhì)�；蚴删w載體可能發(fā)生自身環(huán)化，也可能形成串聯(lián)寡聚物。因而，常常使用堿性磷酸酶去除5’磷酸基團(tuán)以抑制質(zhì)粒DNA的自身連接和環(huán)化。用細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP)或牛小腸堿性磷酸酶（CIP)去除線狀DNA兩端的5’磷酸可以最大限度地減少質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化。而具有5’末端磷酸的外源DNA片段可有效地與去磷酸化質(zhì)粒DNA相連接，產(chǎn)生一個(gè)含有兩個(gè)切口的開(kāi)環(huán)分子。因?yàn)榄h(huán)化DNA（即使只帶切口的環(huán)狀DNA)的轉(zhuǎn)化效率比線狀DNA高得多，所以大多數(shù)轉(zhuǎn)化體都含有重組質(zhì)粒，如圖24-2所示。
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圖24-2 利用磷酸酶防止載體DNA的重新環(huán)化
（三)外源DNA帶有平端的片段
外源DNA片段帶有平端的片段，平端的連接效率比帶有互補(bǔ)末端的DNA要低得多。因此，涉及平端分子的連接反應(yīng)所要求的T4噬菌體DNA連接酶的濃度和外源及質(zhì)粒DNA或噬菌體DNA的濃度都要高得多。
（四)連接反應(yīng)的體系
10×連接緩沖液1μl
10mMATp 1μl
質(zhì)�；蚴删wDNa200ng～1μg
外源DNa 200ng～1μg
T4噬菌DNA連接酶0.5～2nuits
4-6℃溫育8～24h
連接反應(yīng)結(jié)束時(shí)，取1～5μl上述反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化200μl的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，即可將外源DNA與載體接連起來(lái)。
細(xì)菌轉(zhuǎn)化的方法多以Mendel和Higa（1970)的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl2或多種2價(jià)陽(yáng)離子等處理細(xì)菌，使之進(jìn)入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化。
用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌。本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，且迅速、重復(fù)性好。操作過(guò)程簡(jiǎn)述如下。
1．從37℃培m.52667788.cn/job/養(yǎng)16～20h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落（如大腸桿菌DH52)，或1ml新鮮的16～20h過(guò)夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約2～3h（旋轉(zhuǎn)搖床200～300r/min)，每隔20～30min測(cè)量OD600值≈0.4。
2．在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10～20min。
3．于4℃用SorvallGS2轉(zhuǎn)頭（或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min，以回收細(xì)胞。
4．倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。
5．以10ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上。
6．于4℃用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭（或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min，以回收細(xì)胞。
7．倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。
8．每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時(shí)，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存?zhèn)溆谩?/p>
9．用冷卻的無(wú)菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200μl轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的微量離心管中，每管加DNA或連接反應(yīng)混合物（體積≤10μl，DNA≤50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min。
10．將離心管放到預(yù)加溫到40℃的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s～2min，不要搖動(dòng)試管。
11．快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1～2min。
12．每離心管加800μlSOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37℃，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因。
13．將適當(dāng)體積（每個(gè)90mm平板可達(dá)200μl)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/l MgSO4和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上。
14．將平板置于室溫至液體被吸收。
15．倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12～16h后可出現(xiàn)菌落。
1．感受態(tài)細(xì)胞的制備
（1)用JM101或TG1等菌的培養(yǎng)菌液在M9基本培養(yǎng)基平板上的劃線培養(yǎng)，于37℃溫育24～36h。
（2)批量制備凍存的感受態(tài)細(xì)胞的方法，同大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備。
2.用M13噬菌體轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞
（1)用2×YT或SOB培養(yǎng)液于37℃持續(xù)地振搖，將用于鋪平板的細(xì)胞（JM101或TG1等)培養(yǎng)過(guò)夜。
（2)從-70℃以下冰箱中取出一份凍存的JM101或TGI感受態(tài)細(xì)菌，于室溫慢慢融化，立即放在冰上10min。
（3)于各感受態(tài)細(xì)胞管中，加入連接反應(yīng)液，應(yīng)同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照，一個(gè)加5pgM13噬菌體雙鏈環(huán)狀DNA，另一個(gè)則完全沒(méi)有DNA。輕彈管外壁使其混勻，冰浴30min。
（4)取數(shù)支無(wú)菌培養(yǎng)管，分別加入3ml熔化的2×YT或SOB頂層瓊脂，置47℃以備步驟6使用。
（5)將裝有感受態(tài)細(xì)胞和DNA的培養(yǎng)管放入42℃水浴，溫育整整90s，立即將管放回冰浴之中，2min后各管加入1ml過(guò)夜培養(yǎng)的JM101或TG1等菌液，混勻。
（6)在步驟（4)準(zhǔn)備的裝有溶化的2×YT或SOB頂層瓊脂的管內(nèi)各加入40μlX-gal溶液（20mg/ml，溶于二甲基甲酰胺)和4μlIPTG溶液（200mg/ml)振蕩混勻，分別取（5)中混合物各300μl加入各管，振蕩混勻，立即將管內(nèi)混合物傾入標(biāo)記好的LB瓊脂平板上，輕輕旋動(dòng)平皿，以使細(xì)菌與頂層瓊脂分布均勻。
（7)蓋好平皿，于室溫放置5min，使頂層瓊脂凝固，將平板倒置于37℃培養(yǎng)。4個(gè)h后噬斑開(kāi)始出現(xiàn)，8～12h后菌斑不再變化。野生型M13噬菌體形成的噬斑為深藍(lán)色，重組噬菌體則可形成無(wú)色噬斑。
含重組質(zhì)粒的細(xì)胞菌落常用的鑒定方法有：①小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶切分析；②α互補(bǔ)；③插入失活；④雜交篩選。下面簡(jiǎn)要介紹小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性酶切分析。小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA可用天美等公司的Wizard Minipreps DNA試劑盒或采用下述方法：
1.挑取一些獨(dú)立的轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行小規(guī)模培養(yǎng)，用無(wú)菌牙簽或挑種環(huán)挑取單菌落于2ml含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃劇烈振搖下培養(yǎng)過(guò)夜。
2．將1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心30s，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。
3．吸取培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。
4．將細(xì)菌沉淀重懸于200μl溶液Ⅰ中，劇烈振蕩。
溶液Ⅰ 25mmol/L Tris·HCl（pH8.0)
10mmol/LEDTA（pH8.0)
溶液Ⅰ可成批配制，每瓶約100ml，高壓下101bf/m2（6.895×104pa)蒸氣滅菌15min，貯存于4℃。
5．加200μl新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ 0.2mol/L NaOH
1% SDS
蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個(gè)表面均與溶液Ⅱ接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。
6．加200μl溶液Ⅲ
溶液Ⅲ 5mol/l 乙酸甲 60ml
冰乙酸11.5ml
水28.5ml
蓋緊管口，將管倒置，溫和振蕩10min，使溶液Ⅲ在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上m.52667788.cn/rencai/3～5min。
7．用微量離心管于4℃以12000g離心5min，將上清轉(zhuǎn)移另一離心管中。
8．加等量酚和氯仿，振蕩混勻，用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心2min，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。
9．用2倍體積的乙醇于室溫沉淀雙鏈DNA，振蕩混合，于室溫放置2min。
10．用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心5min。
11．小心吸去上清液，將離管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。
12．用1ml70%乙醇于4℃洗滌雙鏈DNA沉淀，按步驟1所述方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀，干燥10min。
13．用50μl含無(wú)DNA酶的胰RNA酶（20μl/ml)的TE重新溶解核酸，振蕩，貯存于-20℃。
14．用適當(dāng)限制性內(nèi)切酶分析所得DNA。
1．感受態(tài)細(xì)胞的制備
（1)將1ml過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌（如DH52、TG1、TM101)接種于100ml2×YT培養(yǎng)于500ml燒瓶。于37℃刷烈振蕩，通�！�200rpm培養(yǎng)的細(xì)菌密度約OD550=0.2～0.5(5×107cells/ml),需2～4h。
（2)將培養(yǎng)物放于冰上致冷10min，于4℃離心細(xì)菌培養(yǎng)物，10000rpm離心10min。
（3)棄除上清，將細(xì)菌懸浮于原始培養(yǎng)體積的一半（約50ml)的50mMCaCl2和10mmTris·HCl（pH8.0)無(wú)菌冷凍液體中。
（4)將細(xì)菌懸浮放在冰上約5min，然后將懸浮物于4℃10000/rpm離心10min。
（5)棄上清，懸浮細(xì)菌于原始培養(yǎng)體積的1/15的50mMCaCl和10mMTris·HCl（pH8.0)無(wú)菌冷凍中。此時(shí)的細(xì)胞是感受態(tài)細(xì)胞，即可用于轉(zhuǎn)化。200μl分裝于無(wú)菌的1.5ml微量離心管中，貯存于-80℃冰箱中。
2．轉(zhuǎn)化程序
（1)取出200μl感受態(tài)細(xì)胞慢慢使其溶化，并立即放于冰上，加入DNA或連接反應(yīng)混合物，DNA量通�！�50mg。用手指彈打試管10次，使之混勻，然后放在冰上40～45min。
（2)將管放于42℃水浴中2min。
（3)然后每管直接加入1.0ml2×YT培養(yǎng)基，倒置混勻，并于37℃培養(yǎng)8～12h，干浴或水浴，不需振搖。此期間使細(xì)菌生長(zhǎng)并開(kāi)始表達(dá)抗菌素。
（4)每200μl轉(zhuǎn)化混合物分別于6個(gè)2×YT瓊脂培養(yǎng)板上補(bǔ)充相應(yīng)抗生素，并含有X-gal（20mg/ml)、IPTG（200mg/ml)。
（5)鋪板使細(xì)菌混合物干后，倒轉(zhuǎn)平板放于30～37℃培養(yǎng)箱中18～22h�？寺≡诖似陂g應(yīng)該出現(xiàn)，否則轉(zhuǎn)化不成功。
