從DNA水平上尋找確診遺傳病的指標(biāo)或探討遺傳病和腫瘤的病因等方面,已取得很大成績,這對產(chǎn)前診斷,早期確診和突變基因攜帶者的檢出等都有重要意義。所用的方法大體有以下幾種。
利用DNA離體轉(zhuǎn)化,制備探針,制備基因文庫進(jìn)行篩檢,最后鑒定載體中插入DNA片段的特性等一系列技術(shù),可以設(shè)法分離出目的基因或某一特定的DNA順序。然后通過DNA核苷酸順序分析可以弄清楚某些疾病的病因。比如,人體癌基因的分離和研究癌基因同原癌基因在DNA的結(jié)構(gòu)與功能上的差別,對了解細(xì)胞癌變的機(jī)制起了很大的作用。分離目的基因或?qū)R籇NA順序更常用的是制備分子雜交探針,通過Southern印跡雜交或Northern印跡雜交等,了解某些遺傳病患者基因結(jié)構(gòu)上的差別,從而找到可靠的診斷方法。比如,患者的基因是否缺失,重排以及是否存在限制性片段長度的多肽現(xiàn)象等。
DNA限制性片段長度多態(tài)性(restricitionfragment length polymorphism, RFLPs)連鎖分析法是指由于缺失、重排或堿基置換的結(jié)果,使DNA分子中原有的某種限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)發(fā)生改變,或是消失或是增加,所以酶切后生成的DNA片段的長度也隨之改變。這種DNA限制性片段長度的變化往往同某種疾病的連鎖關(guān)系,因而可作為這種疾病的診斷指標(biāo)。
如果所分析的DNA分子不太大,比如人體線粒體DNA,長16569bp。在這種DNA分子上每種限制酶的識別點(diǎn)不過幾個(gè)到幾十個(gè),因此,當(dāng)某種限制酶的識別點(diǎn)發(fā)生改變并經(jīng)過這種酶切后,可清楚地看到DNA電泳帶的圖型發(fā)生改變,條帶或者增加或是減少,條帶所處的位置也有變化?墒,遺傳病病例分析時(shí)所用的是基因組DNA,而基因組DNA從限制酶酶切后至少會(huì)生成100萬個(gè)片段,多的可達(dá)1000萬個(gè)片段。如果其中有一、二個(gè)片段發(fā)生改變,不可能從電泳凝膠上直接觀察分辨。此時(shí)就必定要用合適的探針。某個(gè)目的基因或某一特定的DNA片段,在同酶切后的DNA作分子雜交后,可在曝光的X線片上看到RFLP。圖23-8是用分子雜交法檢測RELP示意圖。
圖23-8 分子印跡雜交法則 RFLPs的示意圖
這是通過限制酶A識別點(diǎn)的改變出現(xiàn)DNA的RFLP,再以合適的DNA片段作為分子雜交的探針,在探針上標(biāo)記了放射性同位素,同分別經(jīng)酶A,酶B完全酶切的DNA作印跡雜交。在曝光后的X線m.52667788.cn/sanji/片上可看到不同的雜交帶圖型。①是正常個(gè)體,經(jīng)酶A和酶B切后的DNA同探針雜交,都只看到一條帶。②是一個(gè)雜合子即隱性突變基因攜帶者的雜交圖式,由于它的一條染色體的DNA分子中酶A的識別點(diǎn)發(fā)生改變,酶切后的DNA片段較原來的長,所以出現(xiàn)一長一短兩個(gè)片段。③是突變基因純合子,也就是患者,酶A和B的酶切片段雖然是各有一個(gè),但A的片段比正常的個(gè)體長,所以雜交帶出現(xiàn)的位置也有改變。從圖23-8可以看出研究RFLP的兩個(gè)重要因素,一是要制備合適的探針,二是要用盡可能多的各種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切和雜交。
1974年首次用RFLP作為遺傳學(xué)分析的方法。1978年簡悅威和Dozy等第一次用人體β珠蛋白基因作為探針,同限制酶Hpa Ⅰ酶切的DNA做雜交,發(fā)現(xiàn)了DNA的RFLP與鐮形細(xì)胞貧血之間的關(guān)系(表23-4)。
表23-4 DNA的RFLP與鐮形細(xì)胞貧血的關(guān)系
Hb基因型 | Hpa Ⅰβ珠蛋白基因片段(kb) | 總計(jì) | 13.0kb片段的頻率 | ||||
7.6/7.6 | 7.6/7.0 | 7.0/13.0 | 7.6/13.0 | 13.0/13.0 | |||
黑人AA | 8 | 6 | 0 | 2 | 0 | 15 | 0.03 |
AS | 5 | 1 | 1 | 9 | 0 | 16 | 0.31 |
SS | 0 | 0 | 0 | 4 | 11 | 15 | 0.87 |
白人AA | 12 | 0 | 0 | 0 | 0 | 12 | 0 |
亞洲人AA | 15 | 0 | 0 | 0 | 0 | 15 | 0 |
由此可以看出,HpaⅠβ珠蛋白基因13.0kb片段可作為檢出鐮形細(xì)胞貧血及攜帶者的一種指標(biāo)。1981年Geever等根據(jù)鐮形細(xì)胞貧血是β珠蛋白第6個(gè)密碼子的一個(gè)核苷酸置換的結(jié)果,用限制酶Ddem.52667788.cn/shiti/Ⅰ酶切DNA后與β珠蛋白基因雜交。結(jié)果是:Hb基因型AA的正常個(gè)體有175bp和201bp二條帶。SS個(gè)體即患者只有一條帶,是正常人兩個(gè)DNA片段長度之和,即376bp。AS雜合子則有三條帶:175bp、201bp、376bp。其原因是第6個(gè)密碼子中的A被T置換,使Hb A變成了HbS。限制酶DdeI的識別順序?yàn)镃↓TNAG,當(dāng)A變成T后,該部位DNA順序變成CTNTG,從而丟失了一個(gè)DdeI識別位點(diǎn),所以HbA的2個(gè)DdeI片段(175bp、201bp)變成了HbS的一個(gè)DdeI片段(175+201=376bp)。
除了用基因作探針直接檢測基因內(nèi)的核苷酸變化引起的RFLP外,還有兩種途徑:一是用基因作探針,檢測該基因兩側(cè)順序中核苷酸變化引起的RFLP,確定這些RFLP與遺傳病之間有無連鎖關(guān)系。另一種是用克隆的專一DNA順序作探針,檢測基因兩側(cè)順序DNA的RFLP與遺傳病的連鎖關(guān)系。迄今用上述三種方法已查明近30種遺傳病可通過RFLP來檢測。表23-5、6、7為部位舉例。
表23-5 用基因作探針檢測基因內(nèi)的結(jié)構(gòu)變化來直接分析遺傳病
遺傳病 | 探針 | 年代 |
抗凝血酶Ⅲ缺乏癥 | 抗凝血酶Ⅲ基因 | 1983 |
α1抗胰蛋白酶缺乏癥 | 合成的寡核苷酸 | 1983 |
動(dòng)脈粥樣硬化癥 | 載脂蛋白A-基因 | 1983 |
糖尿病 | 胰島素基因 | 1983 |
Ehlers-Danlos綜合癥 | α(1)膠原蛋白基因 | 1983 |
生長激素缺乏癥 | 生長激素基因 | 1981 |
乙型血友病 | 凝血因子ⅠⅩ基因 | 1983 |
遺傳性胎兒血紅蛋白持存癥 | β珠蛋白基因 | 1979,1983 |
HPRT缺乏癥 | HPRT基因 | 1983 |
自毀容貌綜合征 | HPRT基因 | 1983 |
成骨不全 | 原α1(1)膠原蛋白基因 | 1983 |
視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 | Rb基因 | 1983 |
鐮形細(xì)胞貧血 | 合成的寡核苷酸 | 1983 |
地中海貧血 | β珠蛋白基因 | 1981 |
α和β珠蛋白基因 | 1978,1980 | |
甲型血友病 | 凝血因子Ⅷ基因 | 1985 |
表23-6 用克隆的DNA片段作探針檢測連鎖的RFIP間接分析遺傳病
遺 傳 病 | 探 針 | 探針與疾病基因座位間距離(cm)* | 年 代 |
脆性X綜合征 | PN1,VK21,U6-2 | <5 | 1989 |
慢性進(jìn)行性舞蹈病 | G8 | <10 | 1983 |
Menkes鋼發(fā)癥 | L1,28 | 16 | 1983 |
肌營養(yǎng)不良 | |||
良性假肥大型 | XJ和per+87系列 | ?/FONT> | 1983 |
假肥大型 | XJ和per+87系列 | ?/FONT> | 1986 |
強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良 | 補(bǔ)體C3基因 | 7 | 1983 |
類固醇-硫酸酯酶-X鏈鎖甲癬 | λRC8 | 25 | 1983 |
視網(wǎng)膜劈裂癥(Retinoschisis) | λRC8 | 15 | 1983 |
表23-7 用基因作探針檢測緊密連鎖的RFLP間接分析遺傳病
遺傳病 | 基因探針 | 年代 |
糖尿。á蛐) | 胰島素基因 | 1981,1983 |
生長激素缺乏癥(Ⅰ型) | 生長激素基因 | 1982 |
高甘油三酯血癥 | 載脂蛋白A-1基因 | 1983 |
苯酮尿癥 | 苯丙氨酸羥化酶基因 | 1983 |
除了遺傳病與RFLP之間的關(guān)系的資料,還發(fā)現(xiàn)人體癌基因Ha-ras的Bam HI片段的長度可在6.75~8.7kb之間變動(dòng)。這種RFLP是由于Ha–ras基因有一段可變串聯(lián)重復(fù)順序(vari-able tandem replication,VTR)。重復(fù)順序長28bp、重復(fù)次數(shù)可以不同,所以造成BamHⅠ片段的長度變化。圖23-9中左圖箭頭是某種酶的切點(diǎn),黑框代表可變串聯(lián)重復(fù)順序。右圖代表某種酶切割后,不同個(gè)體顯示的電泳圖譜。1/1、2/2、3/3代表1、2、3等位基因的純合子;1/2、1/2、2/3代表三種可能的雜合子,由于重復(fù)順序數(shù)目不同改變了該酶的切點(diǎn)位置,因而形成不同長度的DNA片段。除Ha-ras癌基因外,成人多囊腎(adult polycystic kidney)基因旁也出現(xiàn)VTR,現(xiàn)已用它作攜帶者及產(chǎn)前診斷。
圖23-9 可變串聯(lián)重復(fù)順序(VTR)示意圖
1988年Higuchi等報(bào)道,可以從人的單根毛發(fā)的毛囊細(xì)胞中抽提DNA,并結(jié)合運(yùn)用DNA聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù),分析了單根毛發(fā)細(xì)胞中抽提的線粒體DNA的D環(huán)區(qū)(D-loopregion)的“DNA”指紋圖”。
PCR技術(shù)由Mullis等首創(chuàng)(詳見第二十二章 )。它又稱為DNA體外擴(kuò)增技術(shù),是用DNA聚合酶在體外擴(kuò)增一段DNA順序達(dá)百萬倍以上。這樣就可直接觀察而不用印跡雜交法。這項(xiàng)技術(shù)的基本原理是,將有待擴(kuò)增的DNA分子加熱變性成為單鏈,然后加入按欲擴(kuò)增DNA片段兩端核苷酸順序合成的一對引物和耐高溫的DNA聚合酶,這樣就可以單鏈DNA分子為模板合成了它的互補(bǔ)鏈。接著再加熱使DNA雙鏈解鏈。由于這類DNA聚合酶是耐高溫的,所以在熱變性處理后仍保持酶活性,在有引物分子存在的條件下又繼續(xù)合成該DNA片段。如此循環(huán)往復(fù)20~30多個(gè)周期,微量的DNA分子可增加10萬~100萬個(gè)拷貝。
這種技術(shù)在醫(yī)學(xué)上有很大的用途。先是Saiki等(1985)將其用于鐮形表細(xì)胞性貧血的快速診斷。繼而Chehab等將其用于Barts胎兒水腫綜合征的前診斷(缺失純合型)。我國吳冠蕓、曾溢滔、蔡仕萍、張基增等在不同實(shí)驗(yàn)室將PCR結(jié)合寡核苷酸探針法用于已知點(diǎn)突變的β地中海貧血的產(chǎn)前診斷,并不斷簡化技術(shù)。目前PCR技術(shù)已用于許多疾病的診斷及產(chǎn)前診斷(如血友病、假肥大性肌營養(yǎng)不良、α1抗胰蛋白酶缺乏癥、艾滋病等)。原則上已知DNA順序的基因及突變性質(zhì)的遺傳病都可以應(yīng)用此技術(shù)。此外,PCR還可用于直接做DNA順序分析。