密碼子具有兼并性，如表22-4，單以氨基酸順序推測編碼的DNA序列是不精確的，但可以設(shè)計成對兼并引物，擴(kuò)增所有編碼已知順序的核酸序列。用兼并引物時寡核苷酸中核苷酸序列可以改變，但核苷酸的數(shù)量應(yīng)相同。兼并度越低，產(chǎn)物特異性越強(qiáng)，設(shè)計引物時應(yīng)盡量選擇兼并性小的氨基酸，并避免引物3’末端兼并，針對兼并的混合引物已成功地用于未知靶DNA的擴(kuò)增、克隆和序列分析。現(xiàn)已成功地克隆了豬尿酸氧化酶基因、糖尿病相關(guān)肽基因和哺乳動物與禽類的嗜肝病毒基因。用脫氧肌苷（deoxyinosine；DI)引物進(jìn)行PCR，可以代替編碼蛋白的多種兼并密碼子中的兼并堿基，DI的特異性主要受cDNA濃度影響。
表22-4 密碼兼并性
| 氨基酸 | 密碼子數(shù) |
| M、W | 1 |
| C、D、E、F、H、K、N、Q、Y | 2 |
| I | 3 |
| A、G、P、T、V | 4 |
| L、R、S | 6 |
注：選擇使用的肽鏈最好避開有4～6個密碼子的氨基酸
用第一套引物擴(kuò)增15～30個循環(huán)，再用擴(kuò)增DNA片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴(kuò)增15～30個循環(huán)，這樣可使待擴(kuò)增序列得到高效擴(kuò)增，而次級結(jié)構(gòu)卻很少擴(kuò)增。用起始引物限量方法或Centricon30(Amicon)分子濾過器離心，在第二套引物加入前去除第一引物。此方法已成功地用來分析中國倉鼠卵巢細(xì)胞AS52的分子突變。AS52細(xì)胞含有單拷貝的細(xì)胞gpt（guanine phos－phribosytransferase)基因，與哺乳動物具有同源性。套式引物PCR減少了引物非特異性退火，從而增加了特異性擴(kuò)增，提高了擴(kuò)增效率。對環(huán)境樣品中微生物檢測和單拷貝的基因靶DNA的擴(kuò)增是非常有效的。
若將套式PCR的內(nèi)外引物稍加改變，延長外引物長度（至25～30bp)，同進(jìn)縮短內(nèi)引物長度（15～17bp)，使外引物先在高溫退火溫度下做雙溫循環(huán)擴(kuò)增，然后改換至三溫循環(huán)，使內(nèi)引物在外引物擴(kuò)增的基礎(chǔ)上作低溫火溫度的三溫循環(huán)直到擴(kuò)增完成，這樣就可以使兩套引物一次同時加入，兩種循環(huán)一氣呵成，等于只做一次PCR，而靈敏度與套式二次PCR無異，在我們最近推出的PTc 51氣流式DNA熱循環(huán)儀上就可以完成全部程序。
套式一次PCR的成功，使PCR檢測的全過程可以在5h內(nèi)完成，使當(dāng)天出檢驗報告成為現(xiàn)實，也使PCR檢測走入臨床有了現(xiàn)實的基礎(chǔ)。
用多對引物同時擴(kuò)增幾條DNA片段的方法稱為復(fù)合PCR。這一方法最初是由Chanberlain 等檢測人的基因發(fā)展而來。Bej等隨之發(fā)展了對環(huán)境樣品中不同屬細(xì)菌相關(guān)基因序列同時PCR擴(kuò)增的檢測方法。兩種不同的軍團(tuán)菌（legionella)基因，一為特異嗜肺L基因（mip)，另一種為L-5SrRNA基因，通過引物搖擺（staggered)添加進(jìn)行復(fù)合PCR。首先mip引物PCR擴(kuò)增7個循環(huán)，然后加入5SrRNA引物PCR擴(kuò)增38個循環(huán)。加入不同量的LacZ和LacB基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增可以檢測大腸桿菌和與人類糞便污染有關(guān)的細(xì)菌包括E.coli大腸菌、腸源致病沙門氏菌和志賀氏菌。
在復(fù)合PCR中，所有引物Ta值應(yīng)相近。如果兩對引物Tq值差異超過±℃10%，會使擴(kuò)增產(chǎn)物的量明顯不同，其中一種擴(kuò)增產(chǎn)物或目的DNA很難觀察到。另外，靶DNA的長度也應(yīng)相近，差別大時短片的靶DNA會優(yōu)先擴(kuò)增，因此，會產(chǎn)生不同產(chǎn)量的擴(kuò)增產(chǎn)物，為此，須采用DNA搖擺擴(kuò)增或加入不等量的引物方法進(jìn)行解決。
反向PCR的目的在于擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說這一反應(yīng)體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA（見圖22-2)。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。這時選擇的引物雖然與核心DNA區(qū)兩末端序列互補(bǔ)，但兩引物3’端是相互反向的。擴(kuò)增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一個環(huán)狀DNA分子，通過反向PCR擴(kuò)增引物的上游片段和下游片段；現(xiàn)已制備了酵母人工染色體（YAC)大的線狀DNA片段的雜交探針，這對于轉(zhuǎn)座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA片段序列的識別十分重要。
該方法的不足是：①需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA。②大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時也會有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。
利用反向PCR可對未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析，探索鄰接已知DNA片段的序列，并可將僅知部分序列的全長cDNA進(jìn)行分子克隆，建立全長的DNA探針。適用于基因游走、轉(zhuǎn)位因子和已知序列DNA旁側(cè)病毒整合位點分析等研究。
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圖22-2 反向PCR原理示意圖
波浪線代表靶DNA，方塊代表測翼序列，▲和△代表限制酶切位
點，寡核苷酸引物與模板互補(bǔ)處標(biāo)有平箭頭
不對稱PCR的基本原理是采用不等量的一對引物產(chǎn)生大量的單鏈DNA（ss-DNA)。這兩種引物分別稱為限制性引物與非限制性引物；其最佳比例一般為1：50～1：100，關(guān)鍵是限制引物的絕對量。限制性引物太多太少，均不利于制備ss-DNA。也可用普通PCR制備靶DNA雙鏈DNA（ds-DNA)，再以ds-DNA為模板，只用其中一種過量引物進(jìn)行單引物PCR制備ss-DNA。
產(chǎn)生的ds-DNA與ss-DNA由于分子量不同可以在電泳中分開，而得到純ss-DNA。
不對稱PCR主要為測序制備ss-DNA，尤為用cD－NA經(jīng)不對稱PCR進(jìn)行DNA序列分析是研究真核DNA外顯子的好方法。
LP-PCR（Labelled Primers PCR)是利用同位素、熒光素等對PCR引物5’端進(jìn)行標(biāo)記，據(jù)此檢測目的基因的存在與否，與常規(guī)PCR相比更為直觀，省去了限制性內(nèi)切酶酶切及分子雜交等繁瑣步驟，而且一次可以同時分析多種基因成分，因而特別適合于大量臨床標(biāo)本的基因診斷。目前該方法只對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定性鑒定。
彩色PCR（Colorcomplement assay)直譯為“著色互補(bǔ)性檢測”，是LP-PCR的一種，彩色PCR意譯更為明確：它用熒光染料標(biāo)記引物的5’端。熒光染料JOE和FAM呈綠色熒光；TAMRA呈紅色熒光；COUM呈藍(lán)色熒光。不同熒光標(biāo)記的引物同時參加反應(yīng)，擴(kuò)增后的目的基因會分別帶有引物5’端的染料，通過電泳或離心沉淀，肉眼就可以根據(jù)不同熒光的色澤判斷目標(biāo)基因是否存在及擴(kuò)增基因的類型。通常僅需2種不同顏色的引物，一種作為基因檢測引物；另一種作為控制條件的內(nèi)對照，即可診斷基因缺失、染色體易位或感染某種病毒。檢測多種點突變時，可用更多的色彩，如多點突變的遺傳病、幾種可疑病毒感染、HLA位點分析都可以用彩色PCR同時檢測多個位點。
加端PCR（add-PCR)是使擴(kuò)增產(chǎn)物的5’-末端加一段DNA順序的PCR。設(shè)計加端PCR的引物時，除與模板配對的那一部分外再加上若干堿基，這樣使擴(kuò)增產(chǎn)物的末端加上額外一段DNA，如加上一個限制酶的識別順序或特定功能的DNA片段。Stoflet等報道在結(jié)構(gòu)基因前加上噬菌體T7的啟動子，當(dāng)然也可用于DNA片段的末端標(biāo)記或引入特定的點突變。末端可加堿基的數(shù)量與引物的長短有關(guān)，當(dāng)引物足夠長時擴(kuò)增產(chǎn)物或末端甚至可以加上十幾個到幾十個堿基。
錨定PCR（AnchoredPCR, A-PCR)主要用于分析具有可變末端的DNA序列，Loh等用A-PCR對人外周血淋巴細(xì)胞T細(xì)胞受體α-鏈的mRNA的多變性進(jìn)行了分析。先合成cDNA，并用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在其3’-可變區(qū)末端加上一個PolyG尾巴。Loh等恒定區(qū)與可變區(qū)連接部位設(shè)一個引物，另一個引物是一個具5’-polyG尾巴的引物。帶有PolyG尾巴的引物是一個固定點，它可以并與PolyG尾巴結(jié)合，無論其余部分序列如何，只識別片段末端，利用此法可從前述mRNA中檢出至少20種不同序列，每一種都是獨特的，表明A-PCR不對任何特殊序列有傾向性結(jié)果，可用于T細(xì)胞、腫瘤及其它部位抗體基因的研究。
在聚丙烯管中可以對多種含膜板材料進(jìn)行PCR，而在顯微玻片上用組織細(xì)胞涂片或切片直接進(jìn)行DNA擴(kuò)增的方法就稱為玻片PCR（Slide-PCR)。
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圖22-3 錨定PCR原理示意圖
先將細(xì)胞涂片或呈單層細(xì)胞，然后用甲醇/醋酸（3：1，V/V)、Carnoy溶液、無水乙醇或4%多聚甲醛溶液固定5～15min。用蒸餾水沖洗，干燥，直接使用或保存于-20℃?zhèn)溆�。在玻片上�?0mm×28mm為免疫組化反應(yīng)區(qū)。加入30μl PCR反應(yīng)混合液，其中含10mmol/L TrispH8.3,50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,200μmol/l dNTPs,100nmol/L引物，0.01%（V/V)明膠，0.2%BSA, 2.5u/100μl Taq酶。然后蓋上22mm×40mm的蓋玻片，邊緣用石蠟油封好。把玻片放入PCR熱循環(huán)儀金屬塊上，使金屬塊與樣品呈最大程度接觸，同在聚丙烯管中一樣，進(jìn)行30～40個循環(huán)。對于較短的擴(kuò)增片段在后期循環(huán)中變性溫度可降低。反應(yīng)后，將致冷玻片放在氯仿中除去大部分石蠟油，但不取出蓋玻片，用一個尖鑷子輕輕拈起蓋玻片一角，在相對的一角中PCR反應(yīng)混合液呈半月形液面，用移液器回收。一般可回收25μl混合液，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳或用套式PCR引物按標(biāo)準(zhǔn)PCR進(jìn)行重新擴(kuò)增。片上擴(kuò)增物可做原位雜交顯示。
在Slide-PCR中，需0.1%～1%的BSA。加入BSA可以保證擴(kuò)增結(jié)果，但效率不一定很高。明膠（至少0.0001%),對擴(kuò)增1kb左右的靶DNA十分重要。但對小片段擴(kuò)增結(jié)果影響不大。不同的樣品提取方法或固定法對Slide-PCR都可行。
Silde-PCR的機(jī)理可能是在起始變性過程中一部分DNA從細(xì)胞中洗提出來，然后在細(xì)胞和玻片的水相中進(jìn)行PCR。用地高辛標(biāo)記的人全基因組DNA探針雜交表明在起始循環(huán)中DNA極微量，而30個循環(huán)后很豐富。常規(guī)細(xì)胞染色表明只有少量的形態(tài)改變。
Silde-PCR對于玻片上的細(xì)胞樣品提供了一種較好的方法，而不必再把這些樣品從玻片上括下來，使操作簡便，污染減少。本方法對于原樣品量極微且需病史追蹤保存的（如子宮頸涂片或涂片)具有實用價值。
RNA的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)是以RNA為模板，聯(lián)合逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（reverse transcrip－tion, RT)與PCR，可用于檢測單個細(xì)胞或少數(shù)細(xì)胞中少于10個拷貝的特異DNA，為RNA病毒檢測提供了方便；并為獲得與擴(kuò)增特定的RNA互補(bǔ)的cDNA提供了一條極為有利和有效的途徑。
RNA擴(kuò)增包括兩個步驟：①在單引物的介導(dǎo)下和逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成RNA的互補(bǔ)鏈cDNA；②加熱后cDNA與RNA鏈解離，然后與另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成雙鏈靶DNA，最后擴(kuò)增靶DNA。
在RT-PCR中關(guān)鍵步驟是RNA的逆轉(zhuǎn)錄，cDNA的PCR與一般PCR條件一樣。由于引物的高度選擇性，細(xì)胞總RNA無需進(jìn)行分級分離，即可直接用于RNA的PCR。但RT-PCR對RNA制品的要求極為嚴(yán)格，作為模板的RNA分子必須是完整的，并且不含DNA、蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)。RNA中即使含有極微量的DNA，經(jīng)擴(kuò)增后也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增；蛋白質(zhì)未除凈，與RNA結(jié)合后會影響逆轉(zhuǎn)錄和PCR；殘存的RNase極易將膜板RNA降解掉。硫氰酸胍（GaSCN)-CsCl法或酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法可提得理想的RNA制品，尤以后者方法為佳，適合一般實驗室進(jìn)行。
常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種，即禽類成髓細(xì)胞性白血病病毒（Avianmyeloblastosis virus, AMV)和莫洛尼鼠類白血病病毒（Moloney murineleukm.52667788.cn/wsj/emia virus, MO-MLV)的逆轉(zhuǎn)錄酶（RT)。一般情況下用Mo-MLV-RT較多，但模板RNA的二級結(jié)構(gòu)嚴(yán)重影響逆轉(zhuǎn)錄時，可改用AMV-RT，因后者最適溫度為72℃，高于Mo-MLV-RT的最適溫度（37℃)，而較高的反應(yīng)溫度有助于消除RNA的二級結(jié)構(gòu)。
一步法擴(kuò)增（one step amplification)是為了檢測低豐度mRNA的表達(dá)，利用同一種緩沖液，在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、Taq酶、4種dNTP直接進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增。發(fā)現(xiàn)Taq酶不僅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，可利用其雙重作用在同一體系中直接以mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和其后的PCR擴(kuò)增，從而使mRNA的PCR步驟更為簡化，所需樣品量減少到最低限度，臨床小樣品的檢測非常有利。用一步法擴(kuò)增可檢測出總RNA中小于1ng的低豐度mRNA。該法還可用于低豐度mRNA的cDNA文庫的構(gòu)建及特異cD－NA的克隆，并有可能與Taq酶的測序技術(shù)相組合，使得自動反轉(zhuǎn)錄、基因擴(kuò)增與基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測序在一個試管中進(jìn)行。
最近Cetus公司推出rTth逆轉(zhuǎn)錄酶，兼具有DNA多聚酶的活性，對于RNA的發(fā)展起了很大的推動作用。有關(guān)rTth逆轉(zhuǎn)錄酶法參考第四節(jié) 有關(guān)內(nèi)容。
1．DNA-PCR定量用同位素標(biāo)記的探針與電泳分離后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，根據(jù)放射自顯影后底片曝光強(qiáng)弱可以對模板DNA進(jìn)行定量。Abbot等利用這種方法對人類T細(xì)胞白血病反轉(zhuǎn)錄基因進(jìn)行了定量研究。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用專為檢測ds-DNA而設(shè)計的微量熒光計定量，利用染料H33258專與雙鏈DNA結(jié)合而使熒光增強(qiáng)50倍的特性�？梢詮臉�(biāo)準(zhǔn)模板系列稀釋擴(kuò)增產(chǎn)物量曲線上讀出樣品中模板DNA的量或拷貝數(shù)，達(dá)到PCR定量的目的。
利用倍比稀釋模板作系列稀釋PCR，求出最低（PCR-EB)檢測限來比較，也是常用的半定量PCR方法。
2．mRNA-PCR定量由于MRNA-PCR定量需經(jīng)兩個酶（RT和Taq)催化，因而影響因素較多。1989年Wang等報道了低豐度mRNA絕對定量方法。利用濃度已知且與待測靶mR-NA序列相同的內(nèi)對照mRNA（其片段長短不同，便于PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物的分離)，在同一體系中，用相同的由32P標(biāo)記的引物與待測mRNA一同進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后，分別測定二者產(chǎn)物放射性強(qiáng)度，由預(yù)先制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出每個樣本特異www.med126.commRNA的量。Gilliland等的結(jié)果表明，在1ng總RNA中可以對小于1pg的特異mRNA進(jìn)行定量。這一定量方法在腫瘤、代謝失調(diào)、基因表達(dá)調(diào)控等研究中均有重要意義。
