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實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第二節(jié) PCR技術(shù)的原理

PCR是體外酶促合成特異DNA片段的新方法,主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成:即在高溫(95℃)下,待擴(kuò)增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板;而后在低溫(37~55℃)情況下,兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補(bǔ)的單鏈DNA模板結(jié)合,形成部…

PCR是體外酶促合成特異DNA片段的新方法,主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成:即在高溫(95℃)下,待擴(kuò)增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板;而后在低溫(37~55℃)情況下,兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補(bǔ)的單鏈DNA模板結(jié)合,形成部分雙鏈;在Taq酶的最適溫度(72℃)下,以引物3’端為合成的起點(diǎn),以單核苷酸為原料,沿模板以5’→3m.52667788.cn/yaoshi/’方向延伸,合成DNA新鏈。這樣,每一雙鏈的DNA模板,經(jīng)過(guò)一次解鏈、退火、延伸三個(gè)步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復(fù)進(jìn)行,每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板,每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴(kuò)增一倍,PCR產(chǎn)物得以2n的批數(shù)形式迅速擴(kuò)增,經(jīng)過(guò)25~30個(gè)循環(huán)后,理論上可使www.med126.com基因擴(kuò)增109倍以上,實(shí)際上一般可達(dá)106~107倍。

圖22-1 PCR基本原理示意圖

假設(shè)擴(kuò)增效率為“X”,循環(huán)數(shù)為“n”,則二者與擴(kuò)增倍數(shù)“y”的關(guān)系式可表示為:y=(1+X)n。擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)即n=30時(shí),若X=100%,則y=230=1073741824(>109);而若X=80%時(shí),則y=1.830=45517159.6(>107)。由此可見(jiàn),其擴(kuò)增的倍數(shù)是巨大的,將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外灶照射下(254nm)一般都可見(jiàn)到DNA的特異擴(kuò)增區(qū)帶。

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