消化道含有大量酶類，這些酶多由胃腸道粘膜中的相應細胞產(chǎn)生和分泌。用免疫細胞化學研究酶的分布及含量改變對某些消化道疾病的病因和診斷有較大價值。近年來，對溶菌酶的研究較多。以往的研究認為溶菌酶是粒性白細胞所分泌�，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)巨噬細胞、單核細胞和血清中含有溶菌酶。用免疫細胞化學染色發(fā)現(xiàn)胃腸道某些腺體細胞也能分泌，且在不同病變中出現(xiàn)不同分泌特點。
1．組織固定和加工用冰凍組織切片可直接進行溶菌酶免疫細胞化學研究。用冷酒精固定，4%福爾馬林緩沖液或1.5%戊二醛固定均能進行免疫細胞化學染色。但浸蠟時溫度不能超過60℃，載玻片應涂薄層明膠以防組織切片脫落。載片后，組織切片應放在50～56℃的烤箱中干燥但不能放在底層，因烤箱底層溫度不均勻。組織切片應避免接觸含油類的手和容器。組織塊應放在4℃密閉容器內(nèi)干燥保存。脫蠟一定要完全。
2．染色方法的選擇根據(jù)具備的抗體和標記抗體，免疫熒光和免疫酶技術(shù)均可采用。間接法、PAP法和ABC等方法均可以選擇。大部分報道多采用冷凍切片和ABC染色方法。ABC方法特異性強，敏感性高，非特異性染色少。目前國內(nèi)已有ABC試劑盒生產(chǎn)。普遍認為國外Vectastain 實驗室生產(chǎn)的Vectastain Elite ABC kit試劑盒較好，其敏感性比Vectastain ABC peroxidase kit高5倍。如果加大第一個抗體的濃度，可進行快速染色，整個染色過程只需30min。如果要進行雙標記染色，可在DAB顯色液作用后組織切片再進行另一種抗體染色，最后在DAB顯色液中加氯m.52667788.cn/wsj/化鎳，使陽性部位顯示紫色。與DAB顯示紅棕色比較，反差明顯。
3．ABC染色步驟疊氮鈉能抑制過氧化酶活性，不宜用以稀釋ABC試劑盒中的試劑。第一抗體應用0.1%結(jié)晶狀的牛血清白蛋白溶液稀釋。所用緩沖液最好新鮮配制，ABC試劑用玻璃瓶裝的蒸餾水稀釋，去離子水可能含過氧化酶抑制劑，能降低敏感性，不宜采用。具體步驟是：①新鮮組織冰凍切片后空氣干燥或風干10min。②切片用丙酮或95%酒精固定10min后PBS沖洗3次，共10min。（也可先固定，后切片，再清洗)。③在0.3%H2O2甲醇中放置20min后PBS沖洗3次，每次5min。④用正常兔血清稀釋孵育20min后，用濾紙吸取過多的血清，并擦干載片中組織周圍的液體，但不能使組織干燥，并用彩色筆在組織周圍圈畫以防抗體液流失。⑤加鼠抗溶菌酶稀釋抗血清，在室溫下放置30min或在4℃過夜m.52667788.cn后BPS洗10min。⑥加生物素化的兔抗鼠血清稀釋液，在室溫下放置30min后PBS洗20min。⑦加稀釋好的Vec-tastain Elite ABC試劑盒中的AB混合液（在使用前30min配好)，再孵育30min，PBS洗10min。⑧組織切片在含0.1%DAB（1mg/ml)和0.02%H2O2的0.1mol/l pH7.6 Tris緩沖液中反應2～7min，自來水沖洗5min（在顯微鏡下觀察結(jié)果，決定反應時間)后甲基綠或蘇木精對比染色，脫水和封片，顯微鏡觀察。
4．結(jié)果判斷溶菌酶主要分布在腺體細胞胞漿內(nèi)，其中以潘氏細胞和杯狀細胞中最明顯，也可以分布在腔面或粘液中。炎性組織中粒性白細胞、巨噬細胞等炎性細胞浸潤較多，也有明顯著色。但是這些細胞多位于固有層內(nèi)，即使個別細胞位于上皮層，其形態(tài)與腺體細胞不同，容易鑒別。當然，這些陽性細胞需與內(nèi)源酶引起的著色相鑒別。
溶菌酶的主要功能是能溶解細菌表面的糖蛋白，具有抗感染的作用。也有人認為能增加吞噬細胞作用，能與各種陰離子分子形成復合物。高濃度溶菌酶能改善細胞膜的功能。溶菌酶的研究包括組織中的分布和血清中含量測定。有人對不同病態(tài)胃粘膜進行研究，發(fā)現(xiàn)除正常幽門腺細胞能合成溶菌酶外，其它胃腺體細胞均無此功能。表淺性胃炎時，胃體胃竇的頸粘液細胞開始具有分泌溶菌酶的功能。腸化生腺體中的潘氏細胞、杯狀細胞、不典型增生的腺體細胞也能產(chǎn)生溶菌酶。作者推測可能慢性胃炎時細菌等感染機會增多，是機體局部產(chǎn)生的對感染的調(diào)節(jié) 反應。有趣的是在胃癌細胞中也發(fā)現(xiàn)溶菌酶而且分化程度越高，分泌溶菌酶功能越強。轉(zhuǎn)移性胃癌細胞和胃腺瘤細胞增色能分泌溶菌酶。其機理還不清楚。
有人對腸道進行研究，發(fā)現(xiàn)正常小腸粘膜杯狀細胞和潘氏細胞能分泌溶菌酶，但含量較低。間質(zhì)內(nèi)粒性白細胞和巨噬細胞也有溶菌酶。但是，正常結(jié)腸和直腸上皮細胞表面和粘液腺體隱窩細胞中沒有溶菌酶，固有層有溶菌酶陽性粒性白細胞。在15例潰瘍性結(jié)腸炎病人中7例在結(jié)腸的直腸上皮細胞胞漿出現(xiàn)溶菌酶，8例克隆氏病人中只有1例陽性。作者認為用免疫細胞化學方法進行溶菌酶的定位研究有助于克隆氏病和潰瘍性結(jié)腸炎病人的鑒別診斷。也有人對結(jié)腸癌進行研究，認為溶菌酶的分布與胃癌相反，結(jié)腸癌分化越高，分泌功能越低、其機理尚不清楚。
血清溶菌酶濃度的測定也曾作為無并發(fā)癥的潰瘍性結(jié)腸炎和活動性克隆氏病的鑒別診斷指標之一。由于80%以上血清溶菌酶多來源于粒性白細胞，不論潰瘍性結(jié)腸炎或克隆氏病都可能引起周圍血管局部粒性白細胞、單核細胞和巨噬細胞增多，因此，血清溶菌酶含量受到影響的因素較多，特異性不高，診斷價值有待進一步研究。
