免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是以酶作為抗原抗體反應(yīng)的標(biāo)記物，在既不改變抗原抗體的免疫反應(yīng)特異性也不影響酶活性的條件下，與相應(yīng)的酶底物作用，形成一種不溶性的反應(yīng)產(chǎn)物。在光學(xué)顯微鏡下觀察時(shí)，要求反應(yīng)的終末產(chǎn)物是不溶性的有色物質(zhì)，具有可觀察性。在電鏡下觀察時(shí)，則要求底物的終末產(chǎn)物具有較高的電子密度。由于辣根過氧化物酶（Horse Radish Peroxidase, HRP)具有穩(wěn)定性強(qiáng)和反應(yīng)特異性高等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最多的酶標(biāo)記物。實(shí)驗(yàn)方法包括酶標(biāo)記抗體法、非標(biāo)記抗體酶法和非標(biāo)記的過氧化物酶—抗過氧化物酶技術(shù)（即PAP法，見第四章 )。
免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可用于包埋前和包埋后染色，但以前者應(yīng)用較多。
（1)用4%多聚甲醛（在0.05mol/l 磷酸緩沖液中，pH7.2)在原位固定（4℃)1h。
（2)用0.05mol/l PBS充分洗滌后，用HRP標(biāo)記的抗體血清作用18h，再用PBS充分洗滌。
（3)2%戊二醛固定1h，再水洗。
（4)呈色反應(yīng)，用DAB—H2O2呈色反應(yīng)，水洗。
（5)1%鋨酸后固定30min～1h，原位用環(huán)氧樹脂包埋，光鏡作半薄切片定位，作超薄切片。
（1)1mm厚組織塊，在4℃下用固定液固定后，置于含4.5%的蔗糖PBS（0.05mol/l pH7.2)，4℃中漂洗，換數(shù)次固定液，過夜。
（2)隨后，作10～40μm的冰凍切片m.52667788.cn/wszg/，放入第一抗體血清作用12～18h，4℃，用含蔗糖的PBS洗數(shù)次。
（3)置于HRP標(biāo)記抗體液（第二抗體)4℃過夜。然后用4℃含蔗糖PBS反復(fù)沖洗數(shù)次。4℃浸漂過夜。
（4)2.5%戊二醛（pH7.4磷酸緩沖液)再固定1h，4℃用含蔗糖PBS反復(fù)沖洗去戊醛，每次5min，共洗3次。
（5)DAB-H2O2顯色15～30min。
（6)0.05mol/l PBS沖洗3次，每次30min，再置于室溫中用1%～2%www.med126.com鋨酸固定1h，脫水、包埋、切片復(fù)染和觀察。
經(jīng)固定組織、應(yīng)用振動(dòng)切片機(jī)（Vibratome)切35～50μm厚片，或用組織鋪片，以漂浮法在反應(yīng)板上進(jìn)行下列步驟：
（1)正常羊血清（1：30PBS稀釋)，室溫孵育30min。
（2)第一抗體（A種動(dòng)物抗血清)，4℃濕盒中48～72h。
（3)羊抗A種動(dòng)物血清（1：100)室溫30min。
（4)A種動(dòng)物血清PAP復(fù)合物（1：100)室溫30min。
（5)DAB·4HCl/H2O2(0.05%/0.01%)，室溫1.5min。上述每一步驟后應(yīng)用PBS洗滌（5min×3次)。
（6)在解剖顯微鏡下檢出免疫反應(yīng)陽性部位，修整組織，用0.1mol/L磷酸緩沖液稀釋的1%鋨酸（pH7.4)后固定30min～1h。
（7)按常規(guī)電鏡樣品制備，脫水、包埋、超薄切片、染色觀察。
（1)將載有切片的鎳網(wǎng)（或金網(wǎng))在5%的H2O2液中蝕刻（etch)2～3min。生理鹽水沖洗，濾紙吸干。
（2)正常羊血清用0.05mol/L Tris鹽液（TBS)稀釋成1：30，pH7.0，室溫5min 。
（3)兔抗血清（第一抗體)，內(nèi)含1%正常羊血清，用0.05%mol/l Tris緩沖液稀釋，pH7.6,4℃，48h后以Tris緩沖液洗滌。
（4)正常羊血清1：30，室溫5min。
（5)羊抗兔1：10（第二抗體，0.05mol/l Tris緩沖液稀釋，pH7.0)，室溫5min，Tris緩沖液洗滌。
（6)正常羊血清1：30，室溫5min。
（7)兔PAP復(fù)合物，內(nèi)含1%正常羊血清，室溫3min,Tris 緩沖液洗滌。
（8)DAB—H2O2液顯色（含H2O20.01%～0.03%),室溫3min。
（9)4%的磷酸鹽緩沖的鋨酸溶液10～15min，蒸餾水洗滌（此步用于改善微細(xì)結(jié)構(gòu)的反差)，電鏡觀察。
在連續(xù)的超薄切片上進(jìn)行，用包埋后染色法在相鄰的兩張切片上分別以不同的抗體進(jìn)行免疫染色�？稍诔Y(jié)構(gòu)水平判定細(xì)胞內(nèi)抗原共存的情況。
