C端       N端。
掛接→去保護(hù)→中和→縮合→去保護(hù)→中和→縮合                 
第五節(jié) 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和纖維狀蛋白質(zhì)
二級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈中有規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象。
一、 肽鏈的構(gòu)象
多肽鏈的共價主鏈上所有的α--碳原子都參與形成單鍵，因此，從理論上講，一個多肽主鏈能有無限多種構(gòu)象。
但是，目前已知，一個蛋白質(zhì)的多肽鏈在生物體內(nèi)只有一種或很少幾種構(gòu)象，且相當(dāng)穩(wěn)定，這種構(gòu)象稱天然構(gòu)象，此時蛋白質(zhì)具有生物活性，這一事實說明：天然蛋白質(zhì)主鏈上的單鍵并不能自由旋轉(zhuǎn)。
1、 肽鏈的二面角
P143圖3-51、圖3-52

多肽主鏈上只有α碳原子連接的兩個鍵（Cα—N1和Cα-C2）是單鍵，能自由旋轉(zhuǎn)。
環(huán)繞Cα—N鍵旋轉(zhuǎn)的角度為Φ
環(huán)繞Cα—C2鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱Ψ
多肽鏈的所有可能構(gòu)象都能用Φ和Ψ這兩個構(gòu)象角來描述，稱二面角。
當(dāng)Φ的旋轉(zhuǎn)鍵Cα-N1兩側(cè)的N1-C1和Cα-C2呈順式時，規(guī)定Φ=0°。
當(dāng)Ψ的旋轉(zhuǎn)鍵Cα-C2兩側(cè)的Cα-N1和C2-N2呈順式時，規(guī)定Ψ=0°。
從Cα向N1看，順時針旋轉(zhuǎn)Cα-N1鍵形成的Φ角為正值，反之為負(fù)值。
從Cα向C2看，順時針旋轉(zhuǎn)Cα- C2鍵形成的Ψ角為正值，反之為負(fù)值。
2、 多肽鏈折疊的空間限制
Φ和Ψ同時為0的構(gòu)象實際不存在，因為兩個相鄰肽平面上的酰胺基H原子和羰基0原子的接觸距離比其范德華半經(jīng)之和小，空間位阻。www.med126.net
因此二面角（Φ、Ψ）所決定的構(gòu)象能否存在，主要取決于兩個相鄰肽單位中非鍵合原子間的接近有無阻礙。
Cα上的R基的大小與帶電性影響Φ和Ψ

P144表3-12      蛋白質(zhì)中非鍵合原子間的最小接觸距離。

拉氏構(gòu)象圖：Ramachandran根據(jù)蛋白質(zhì)中非鍵合原子間的最小接觸距離，確定了哪些成對二面角（Φ、Ψ）所規(guī)定的兩個相鄰肽單位的構(gòu)象是允許的，哪些是不允許的，并且以Φ為橫坐標(biāo)，以Ψ為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)圖上標(biāo)出，該坐標(biāo)圖稱拉氏構(gòu)象圖。

P145  拉氏構(gòu)象圖（Gly除外）

⑴實線封閉區(qū)域
一般允許區(qū)，非鍵合原子間的距離大于一般允許距離，此區(qū)域內(nèi)任何二面角確定的構(gòu)象都是允許的，且構(gòu)象穩(wěn)定。
⑵虛線封閉區(qū)域
是最大允許區(qū)，非鍵合原子間的距離介于最小允許距離和一般允許距離之間，立體化學(xué)允許，但構(gòu)象不夠穩(wěn)定。
⑶虛線外區(qū)域
是不允許區(qū)，該區(qū)域內(nèi)任何二面角確定的肽鏈構(gòu)象，都是不允許的，此構(gòu)象中非鍵合原子間距離小于最小允許距離，斥力大，構(gòu)象極不穩(wěn)定。
Gly的Φ、Ψ角允許范圍很大。
總之，由于原子基因之間不利的空間相互作用，肽鏈構(gòu)象的范圍是很有限的，對非Gly 氨基酸殘基一般允許區(qū)占全平面的7.7%，最大允許區(qū)占全平面20.3％。
二、 二級結(jié)構(gòu)的基本類型
驅(qū)使蛋白質(zhì)折疊的主要動力：
(1)暴露在溶劑中的疏水基團(tuán)降低至最少程度。
(2)要保持處于伸展?fàn)顟B(tài)的多肽鏈和周圍水分子間形成的氫鍵相互作用的有利能量狀態(tài)。
1、 α螺旋
（1）、 α螺旋及其特征
在α螺旋中，多肽主鏈按右手或左手方向盤繞，形成右手螺旋或左手螺旋，相鄰的螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵，構(gòu)成螺旋的每個Cα都取相同的二面角Φ、Ψ。
典型的α螺旋有如下特征：
① 二面角：Φ= -57°, Ψ= - 48°，是一種右手螺旋
回憶 P143圖3-52

② 每圈螺旋：3.6個a.a殘基，  高度：0.54nm
③ 每個殘基繞軸旋轉(zhuǎn)100°，沿軸上升0.15nm
④ 氨基酸殘基側(cè)鏈向外
⑤ 相鄰螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鏈，氫鍵的取向幾乎與中心軸平行。
⑥ 肽鍵上N-H氫與它后面（N端）第四個殘基上的C=0氧間形成氫鍵。
      圖
這種典型的α螺旋用3.613表示，3.6表示每圈螺旋包括3.6個殘基，13表示氫鍵封閉的環(huán)包括13個原子。

2.27螺旋（n=1）
310   螺旋（n=2，Φ= -49°, Ψ= - 26°）
613螺旋（n=3）
4.316螺旋（n=4）
封閉環(huán)原子數(shù)3n+4（n=1、2、.....）
         2.27     310      3.613      4.316
n=1     n=2     n=3      n=4
     α-螺旋   π-螺旋
（2）、 R側(cè)鏈對α—螺旋的影響
R側(cè)鏈的大小和帶電性決定了能否形成α—螺旋以及形成的α—螺旋的穩(wěn)定性。
① 多肽鏈上連續(xù)出現(xiàn)帶同種電荷基團(tuán)的氨基酸 殘基,(如Lys，或Asp，或Glu)，則由于靜電排斥，不能形成鏈內(nèi)氫鍵，從而不能形成穩(wěn)定的α—螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。而當(dāng)這些殘基分散存在時，不影響α—螺旋穩(wěn)定。
② Gly的Φ角和Ψ角可取較大范圍，在肽中連續(xù)存在時，使形成α—螺旋所需的二面角的機(jī)率很小，不易形成α—螺旋。絲心蛋白含50%Gly，不形成α—螺旋。
③ R基大（如Ile）不易形成α—螺旋
④ Pro、脯氨酸中止α—螺旋。
⑤ R基較小，且不帶電荷的氨基酸利于α—螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自發(fā)卷曲成α—螺旋。
（3）、 pH對α—螺旋的影響
多聚L-Glu和多聚L-Lys

P149  圖3-57

（4）、 右手α-螺旋與左手α-螺旋
        圖  P148
右手螺旋比左手螺旋穩(wěn)定。
蛋白質(zhì)中的α—螺旋幾乎都是右手，但在嗜熱菌蛋白酶中有很短的一段左手α—螺旋，由Asp-Asn-Gly-Gly（226-229）組成（φ+64°、Ψ+42°）。
（5）、 α-螺旋結(jié)構(gòu)的旋光性
由于α-螺旋結(jié)構(gòu)是一種不對稱的分子結(jié)構(gòu)，因而具有旋光性，原因：（1）α碳原子的不對稱性，（2） 構(gòu)象本身的不對稱性。
天然α—螺旋能引起偏振光右旋，利用α—螺旋的旋光性，可測定蛋白質(zhì)或多肽中α—螺旋的相對含量，也可用于研究影響α—螺旋與無規(guī)卷曲這兩種構(gòu)象之間互變的因素。
α-螺旋的比旋不等于構(gòu)成其本身的氨基酸比旋的加和，而無規(guī)卷曲的肽鏈比旋則等于所有氨基酸比旋的加和。
（6）、 α-螺旋（包括其它二級結(jié)構(gòu)）形成中的協(xié)同性
一旦形成一圈α-螺旋后，隨后逐個殘基的加入就會變的更加容易而迅速

2、 β-折疊
P149  圖3—58    P150  圖3—59

兩條或多條幾乎完全伸展的多肽鏈（或同一肽鏈的不同肽段）側(cè)向聚集在一起，相鄰肽鏈主鏈上的NH和C=0之間形成氫鏈，這樣的多肽構(gòu)象就是β-折疊片。β-折疊中所有的肽鏈都參于鏈間氫鍵的形成，氫鍵與肽鏈的長軸接近垂直。多肽主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象，側(cè)鏈R基交替地分布在片層平面的兩側(cè)。
平行式：所有參與β-折疊的肽鏈的N端在同一方向。
反平行式：肽鏈的極性一順一倒，N端間隔相同
平行式：φ=-119°    Ψ=+113°
反平行式：φ=-139°    Ψ=+135°
從能量上看，反平β-折疊比平行的更穩(wěn)定，前者的氫鍵NH---O幾乎在一條直線上，此時氫鍵最強(qiáng)。
在纖維狀蛋白質(zhì)中β-折疊主要是反平行式，而在球狀蛋白質(zhì)中反平行和平行兩種方式都存在。
在纖維狀蛋白質(zhì)的β-折疊中，氫鍵主要是在肽鏈之間形式，而在球狀蛋白質(zhì)中，β-折疊既可在不同肽鏈間形成，也可在同一肽鏈的不同部分間形成。
3、 β-轉(zhuǎn)角（β-turn）
β-轉(zhuǎn)角也稱β-回折（reverse turn）、β-彎曲（β-bend）、發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hair-pin structure）
β-轉(zhuǎn)角是球狀蛋白質(zhì)分子中出現(xiàn)的180°回折，有人稱之為發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由第一個a.a殘基的C=O與第四個氨基酸殘基的N-H間形成氫鍵。
目前發(fā)現(xiàn)的β轉(zhuǎn)角多數(shù)在球狀蛋白質(zhì)分子表面，β轉(zhuǎn)角在球狀蛋白質(zhì)中含量十分豐富，占全部殘基的1/4。
β轉(zhuǎn)角的特征：
①由多肽鏈上4個連續(xù)的氨基酸殘基組成。
②主鏈骨架以180°返回折疊。
③第一個a.a殘基的C=O與第四個a.a殘基的N-H生成氫鍵
④C1α與C4α之間距離小于0.7nm
⑤多數(shù)由親水氨基酸殘基組成。
4、 無規(guī)卷曲 
沒有規(guī)律的多肽鏈主鏈骨架構(gòu)象。
球狀蛋白中含量較高，對外界理化因子敏感，與生物活性有關(guān)。
α-螺旋，β-轉(zhuǎn)角，β-折疊在拉氏圖上有固定位置，而無規(guī)卷曲的φ、Ψ二面角可存在于所有允許區(qū)域內(nèi)。
三、 超二級結(jié)構(gòu)
由若干個相鄰的二級結(jié)構(gòu)單元（α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲）組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則的、在空間上能夠辨認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)組合體。
1、 αα結(jié)構(gòu)（復(fù)繞α-螺旋）
由兩股或三股右手α-螺旋彼此纏繞而成的左手超螺旋，重復(fù)距離140A。
p153 圖3-61  A

存在于α-角蛋白，肌球蛋白，原肌球蛋白和纖維蛋白原中。
2、 βxβ結(jié)構(gòu)
兩段平行式的β-鏈（或單股的β-折疊）通過一段連接鏈（x結(jié)構(gòu)）連接而形成的超二級結(jié)構(gòu)。
①βcβ
         x為無規(guī)卷曲
p153 圖3-61  B

②βαβ
        x為α-螺旋，最常見的是βαβαβ，稱Rossmann折疊，存在于蘋果酸脫氫酶，乳酸脫氫酶中。
p153 圖3-61  C
3、 β曲折（β-meander）
由三條（以上）相鄰的反平行式的β-折疊鏈通過緊湊的β-轉(zhuǎn)角連接而形成的超二級結(jié)構(gòu)。

P153圖3-61   D
4、 回形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（希臘鑰匙）
P153圖3-61  E
5、 β-折疊桶
由多條β-折疊股構(gòu)成的β-折疊層，卷成一個筒狀結(jié)構(gòu)，筒上β折疊可以是平行的或反平行的，一般由5-15條β-折疊股組成。
超氧化物歧化酶的β-折疊筒由8條β-折疊股組成。筒中心由疏水氨基酸殘基組成。
6、 α-螺旋-β轉(zhuǎn)角-α-螺旋
兩個α-螺旋通過一個β轉(zhuǎn)角連接在一起。
λ噬菌體的λ阻遏蛋白含此結(jié)構(gòu)。在蛋白質(zhì)與DNA的相互作用中，此種結(jié)構(gòu)占有極為重要的地位。
四、 纖維狀蛋白質(zhì)
纖維狀蛋白質(zhì)的氨基酸序列很有規(guī)律，它們形成比較單一的、有規(guī)律的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果整個分子形成有規(guī)律的線形結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)纖維狀或細(xì)棒狀，分子軸比（軸比：長軸/短軸）大于10，軸比小于10是的球狀蛋白質(zhì)。
廣泛分布于脊椎和無脊椎動物體內(nèi)，占脊椎動物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的50%以上，起支架和保護(hù)作用。
1、 角蛋白
源于外胚層細(xì)胞，包括皮膚及皮膚的衍生物（發(fā)、毛、鱗、羽、甲、蹄、角、爪、絲）可分為α-角蛋白和β角蛋白。
（1）、 α-角蛋白
P155 圖3-63，P156  圖3-64
 
主要由α-螺旋結(jié)構(gòu)組成，三股右手α-螺旋向左纏繞形成原纖維，原纖維排列成“9+2”的電纜式結(jié)構(gòu)稱微纖維，成百根微纖維結(jié)合成大纖微
結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性由二硫鍵保證，α-角蛋白在濕熱條件下可伸展轉(zhuǎn)變成β-構(gòu)象，燙發(fā)的化學(xué)機(jī)理Cys含量較高。
？a-角蛋白(a-Keratin)中有兩種類型的多肽鏈：I型和II型。每一個I型多肽型和一個II型多肽鏈形成一個卷曲螺旋二聚體(Coiled coil dimmer)。一對卷曲螺旋反平行式地形成左手超螺旋結(jié)構(gòu)稱原纖維(Protofilament，4股右手a-螺旋)，原纖維的亞基間以氫鍵和二硫鍵相連。4個原纖維形成微纖維，成百根微纖維形成大纖維，每一個頭發(fā)細(xì)胸，也將纖維(fiber)含有數(shù)個大纖維，一根頭發(fā)就是由無數(shù)的死細(xì)胞相互間以角蛋白相連組成的。？

（2）、 β-角蛋白
P157    圖3-65

含大量的Gly、Ala、Ser，以β-折疊結(jié)構(gòu)為主。
絲心蛋白取片層結(jié)構(gòu)，即反平行式β-折疊片以平行的方式堆積成多層結(jié)構(gòu)。鏈間主要以氫鍵連接，層間主要靠范德華力維系。
2、 膠原蛋白
3、 彈性蛋白
4、 肌球蛋白、肌動蛋白和微管蛋白
第六節(jié) 球狀蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)與功能
前面講了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的兩個較低級的組織水平：一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)（包括超二級結(jié)構(gòu)），本節(jié)講述蛋白質(zhì)（主要是球蛋白）的高級結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)域、三級結(jié)構(gòu)、四級結(jié)構(gòu)，及其與生物功能。
一、 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)
蛋白質(zhì)功能的復(fù)雜性和多樣性是建立在結(jié)構(gòu)多樣性的基礎(chǔ)上。
多肽鏈的二級結(jié)構(gòu)由R基的短程順序決定，當(dāng)一組在肽鏈上相鄰的氨基酸殘基具有適當(dāng)?shù)捻樞驎r，能自發(fā)形成α-螺旋和β-折疊，并處于穩(wěn)定狀態(tài)。
而多肽鏈的三級結(jié)構(gòu)由氨基酸的長程順序決定，如產(chǎn)生特異轉(zhuǎn)彎的氨基酸殘基（Pro、Thr、Ser）的精確位置決定多肽鏈轉(zhuǎn)彎形成的方向和角度。
同源蛋白質(zhì)的不變殘基決定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)。
RNase的變性、復(fù)性實驗，證明蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象歸根結(jié)底是復(fù)雜生物大分子的“自我裝配”。

P164  圖3-69  RNase的變性與復(fù)性示意圖二、 球狀蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域、三級結(jié)構(gòu)與功能
（一） 結(jié)構(gòu)域
結(jié)構(gòu)域(domain)，又稱motif(模塊)
在二級結(jié)構(gòu)及超二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，多肽鏈進(jìn)一步卷曲折疊，組裝成幾個相對獨立、近似球形的三維實體。結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白的折疊單位，多肽鏈折疊的最后一步是結(jié)構(gòu)域間的締合。
對于較小的蛋白質(zhì)分子或亞基來說，結(jié)構(gòu)域和三級結(jié)構(gòu)往往是一個意思，就是說這些蛋白質(zhì)是單結(jié)構(gòu)域的。
結(jié)構(gòu)域一般有１００－２００氨基酸殘基，結(jié)構(gòu)域之間常常有一段柔性的肽段相連，形成所謂的鉸鏈區(qū)，使結(jié)構(gòu)域之間可以發(fā)生相對移動。
每個結(jié)構(gòu)域承擔(dān)一定的生物學(xué)功能，幾個結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，可體現(xiàn)出蛋白質(zhì)的總體功能。例如，脫氫酶類的多肽主鏈有兩個結(jié)構(gòu)域，一個為NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域，一個是起催化作用的結(jié)構(gòu)域，兩者組合成脫氫酶的脫氫功能區(qū)。
結(jié)構(gòu)域間的裂縫，常是活性部位，也是反應(yīng)物的出入口。一般情況下，酶的活性部位位于兩個結(jié)構(gòu)域的裂縫中。

EF手：鈣結(jié)合蛋白中，含有Helix-Loop-Lelix結(jié)構(gòu)
鋅指：DNA結(jié)合蛋白中，2個His、2個Cys結(jié)合一個Zn
亮氨酸拉鏈：DNA結(jié)合蛋白中，由亮氨酸倒鏈形成的拉鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)，
圖5.19
（二） 三級結(jié)構(gòu)：
三級結(jié)構(gòu)：整個多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上盤旋、折疊，形成的特定的整個空間結(jié)構(gòu)。
或者說，三級結(jié)構(gòu)是多肽鏈中所有原子的空間排布。
1、 三級結(jié)構(gòu)有以下特點：
 許多在一級結(jié)權(quán)上相差很遠(yuǎn)的aa堿基在三級結(jié)構(gòu)上相距很近。
‚ 球形蛋白的三級結(jié)構(gòu)很密實，大部分的水分子從球形蛋白的核心中被排出，這使得極性基團(tuán)間以及非極性基團(tuán)間的相互用成為可能。
ƒ 大的球形蛋白(200aa以上)，常常含有幾個結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域是一種密實的結(jié)構(gòu)體，典型情況下常常含有特定的功能(如結(jié)合離子和小分子)
2、 維持三級結(jié)構(gòu)的作用力：
P164   圖3-70

（1）氫鍵
大多數(shù)蛋白質(zhì)采取的折疊策略是使主鏈肽基之間形成最大數(shù)目的分子內(nèi)氫鍵（如α-螺旋、β-折疊），同時保持大部分能成氫鍵的側(cè)鏈處于蛋白質(zhì)分子表面，與水相互作用。
（2）范德華力（分子間及基團(tuán)間作用力）
包括三種弱的作用力：
定向效應(yīng)    極性基團(tuán)間
誘導(dǎo)效應(yīng)    極性與非極性基團(tuán)間
分散效應(yīng)    非極性基團(tuán)間
（3）疏水相互作用
蛋白質(zhì)中的疏水殘基避開水分子而聚集在分子內(nèi)部的趨向力。它在維持蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)方面占有突出的地位。
（4）離子鍵（鹽鍵）
是正電賀和負(fù)電荷之間的一種靜電作用。
生理pH下，Asp、Glu側(cè)鏈解離成負(fù)離子，Ｌys、Arg、His離解成正離子。多數(shù)情況下，這些基團(tuán)分布在球狀蛋白質(zhì)分子的表面，與水分子形成排列有序的水化層。偶爾有少數(shù)帶相反電荷的測鏈在分子的疏水內(nèi)部形成鹽鍵。
（5）共價健，主要的是二硫鍵，
在二硫鍵形成之前，蛋白質(zhì)分子已形成三級結(jié)構(gòu)，二硫鍵不指導(dǎo)多肽鏈的折疊，三級結(jié)構(gòu)形成后，二硫鍵可穩(wěn)定此構(gòu)象。
主要存在于體外蛋白中，在細(xì)胞內(nèi)，由于有高濃度的還原性物質(zhì)，所以沒有二硫鍵。
6、靜電相互作用
最強(qiáng)的靜電作用就是帶相反電何的離子基因間的靜電作用，又稱鹽橋。鹽橋和較弱的靜電相互作用(離子-偶級、偶級-偶級、范德華力)也是維持亞基間以及蛋白質(zhì)與配體間的作用力。
3、 免疫球蛋白的一級結(jié)構(gòu)
P193  圖3-99
第七節(jié) 蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、純化、鑒定
一、 蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)
蛋白質(zhì)也是一類兩性電解質(zhì)，能和酸、堿發(fā)生作用。
在蛋白質(zhì)分子中，可解離基團(tuán)主要是側(cè)鏈基團(tuán)，及少數(shù)N端-NH2和C端-COOH。
P197  表3-16

天然球狀蛋白質(zhì)的可解離基團(tuán)大部分可被滴定，而某些天然蛋白質(zhì)中有一部分可解離基因由于埋藏在分子內(nèi)部或參與氫鍵形成而不能解離。
1、 等電點和等離子點（中性鹽Ca2+、Mg2+、cl、HPO42++）
等電點：
P198表3-17  3-18

蛋白質(zhì)的等電點和它所含的酸性氨基酸殘基和堿性氨基酸殘基的比例有關(guān)。
等離子點：沒有其它鹽類干擾時，蛋白質(zhì)質(zhì)子供體解離出的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子受體結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時的pH值稱等離子點，是每種蛋白質(zhì)的特征常數(shù)。
在等電點條件下，蛋白質(zhì)的電導(dǎo)性、溶解度最小，粘度最大。
2、 蛋白質(zhì)的電泳分離
聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE
         SDS-PAGE（荷質(zhì)比相同，分子量不同）
3、 離子交換層析分離蛋白質(zhì)
與氨基酸分離原理相似
二、 蛋白質(zhì)的大小與形狀
測分子量的方法：
化學(xué)組成法
凝膠過濾法
SDS-PAGE法
三、 膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀
蛋白質(zhì)分子直徑在1-100nm之間，在水溶液中具有膠體溶液的通性（布朗運動，丁達(dá)耳現(xiàn)象，不能通過半透膜）
透析：將含小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)放入透析袋中，置水溶液中，小分子雜質(zhì)不斷從袋中出來，大分子蛋白質(zhì)仍留在袋中。
蛋白質(zhì)在水中溶解度依賴于多肽鏈氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的相對極性，離子化基因數(shù)量越多，溶解度越大。
1、 穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的主要因素
①蛋白質(zhì)表面極性基團(tuán)形成的水化膜將蛋白質(zhì)顆粒彼此隔開，不會互相碰撞凝聚而沉淀。
②兩性電解質(zhì)非等電狀態(tài)時，帶同種電荷，互相排斥不致聚集而沉淀。
一旦電荷被中和或水化膜被破壞，蛋白質(zhì)顆粒聚集，便從溶液中析出沉淀。
2、 沉淀蛋白質(zhì)的方法
①鹽析法  向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽[（NH4）2SO4、Na2SO4、Nacl]，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。
②有機(jī)溶劑沉淀法  破壞水化膜，降低介電常數(shù)
③重金屬鹽沉淀
pH大于等電點時，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，可與重金屬離子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）結(jié)成不溶性沉淀
④生物堿試劑和某些酸類沉淀法
pH小于等電時，蛋白質(zhì)帶正電荷，易與生物堿試劑和酸類的負(fù)離子生成不溶性沉淀。
生物堿試劑：是指能引起生物堿沉淀的一類試劑，單寧酸、苦味酸、鎢酸。
酸 類：三氯乙酸、磺基水楊酸。
⑤加熱變性沉淀。
往往是不可逆的。
四、 蛋白質(zhì)的變性
變性作用：理、化因素影響，使蛋白質(zhì)生物活性喪失，溶解度下降，不對稱性增大及其它理化常數(shù)改變。
（1）變性的因素：
 強(qiáng)酸和強(qiáng)堿；‚ 有機(jī)溶劑，破壞疏水作用；ƒ 去污劑、去污劑都是兩親分子，破壞疏水作用；„ 還原性試劑：尿素、b-硫基乙醇；… 鹽濃度、鹽析、鹽溶；† 重金屬離子，Hg2+、pb2+，能與-SH或帶電基團(tuán)反應(yīng)。‡ 溫度；ˆ 機(jī)械力：如攪拌和研磨中的氣泡。
（2）變性的實質(zhì)：
次級鍵（有時包括二硫鍵）被破壞，天然構(gòu)象解體。變性不汲及一級結(jié)構(gòu)的破壞。
（3）蛋白質(zhì)變性后，往往出現(xiàn)下列現(xiàn)象：
①結(jié)晶及生物活性喪失是蛋白質(zhì)變性的主要特征。
②硫水側(cè)鏈基團(tuán)外露。
③理化性質(zhì)改變，溶解度降低、沉淀，粘度增加，分子伸展。
④生理化學(xué)性質(zhì)改變。分子結(jié)構(gòu)伸展松散，易被蛋白酶水解。
實際應(yīng)用：
A.消毒滅菌：75%乙醇，紫外線，高溫。
B.制備活性蛋白質(zhì)時嚴(yán)防蛋白質(zhì)變性。
（4）變性機(jī)理
①熱變性（往往是不可逆的）多肽鏈?zhǔn)艿竭^分的熱振蕩，引起氫鏈破壞。
②酸堿變性：破壞了鹽鏈。
③有機(jī)溶劑：破壞水化膜，降低蛋白質(zhì)溶液介電常數(shù)。
（5）可逆變性與不可逆變性
有人認(rèn)為：二級、三級或四級結(jié)構(gòu)遭受被破壞即為變性，三級（或四級）結(jié)構(gòu)被破壞時引起可逆變性，而二級及三級（或四級）結(jié)構(gòu)一并遭破壞時引起不可逆變性。
五、 分離純化蛋白質(zhì)的主要方法
實質(zhì)：①蛋白與非蛋白分開，②蛋白質(zhì)之間分開
原理：
1. 溶解度差異
PEG沉淀法
有機(jī)溶劑沉淀法
等電點沉淀法
2. 熱穩(wěn)定性差異
熱處理沉淀法
銅鋅SOD（65℃、15分鐘、穩(wěn)定）
3. 電荷性質(zhì)差異
離子交換層析法
電泳法
4. 分子大小和形狀差異
凝膠過濾、超濾法
透析法、離心法
5. 親和力的差異
親和層析法
某種蛋白質(zhì)能與一種配基特異而非共價結(jié)合。
配基是指能被生物大分子識別并與之結(jié)合的原子、原子團(tuán)和分子，如酶的底物、輔酶、調(diào)節(jié)效應(yīng)物及其結(jié)構(gòu)類似物，激素與受體蛋白、抗原與抗體。
分離原理：
P224  圖3-124

u 蛋白質(zhì)毒素
一些致病生物產(chǎn)生的毒素中有很多是蛋白質(zhì)。毒性機(jī)理有： 破壞細(xì)胞膜；‚ 干擾細(xì)胞內(nèi)機(jī)能；ƒ 抑制神經(jīng)細(xì)胞突觸的功能。
直接作用于細(xì)胞膜的毒素稱溶細(xì)胞毒素，可以由細(xì)菌、真菌、植物、魚、蛇等產(chǎn)生。鏈球菌屬(Streptoccus)Pyogene產(chǎn)生的鏈球菌溶血素(包括0.5等)，能使精細(xì)胞產(chǎn)生孔洞，Na+等離子外滲，細(xì)胞死亡。鏈球菌溶血素O是產(chǎn)生風(fēng)濕熱的原因之一(rheiematie fever)。此外，一些有毒的酶點，如蛇的磷酯酶在A2也能破壞細(xì)胞膜。
破壞細(xì)胞內(nèi)機(jī)能的毒素也很多，如白候桿菌(Corynebacteriadiphtheriae)產(chǎn)生的白候毒素(diphtheria toxin)和霍亂弧菌(Vibrio cholerae)產(chǎn)生的霍亂毒素(cholera toxin)。它們均由A、B兩個亞基組成，B亞基與靶細(xì)胞結(jié)合，A亞基致毒。白候毒素分子一旦進(jìn)入靶細(xì)胞，AB亞在就分開，A亞基是一種酶能阻止蛋白質(zhì)的合成，寄主的心、腎和神經(jīng)組織都會被破壞。
霍亂毒素的B亞基由5個相同亞基組成，B亞基與腸細(xì)胞膜結(jié)合，A亞基就被送入這些細(xì)胞中，A亞基激活一種酶使cAMP大量產(chǎn)生，cAMP打開細(xì)胞膜的CL通道，由于CL-外泄引起滲適壓的改變，水分也大量喪失，結(jié)果導(dǎo)致腹瀉(diarrhoea)，不加治療的話，嚴(yán)重的脫水可使病人48小時內(nèi)死亡。
神經(jīng)突觸連接兩個神經(jīng)元或一個神經(jīng)元與一個肌肉細(xì)胞。一種毒蛻的產(chǎn)生的毒素a-Latrotoxin(125KD)是一條多肽鏈，能剌激神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine, ACH)的廣譜性釋放酶。肉毒桿菌(Lostrldium botulinum)產(chǎn)生的肉毒桿菌毒素(botulinum toxin)能抑制Ach釋放酶肉毒中毒(botulism)為是由于受了被污染的罐袋食物引起的

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