一、標本制作
可制作涂片、印片、細胞單層培養(yǎng)物、組織切片，經(jīng)適當固定或不固定，作免疫熒光染色用。
二、熒光抗體染色方法
（一)直接法
1．染色 切片經(jīng)固定后，滴加經(jīng)稀釋至染色效價如1：8或1：16的熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體或兔抗人IgG或IgA熒光抗體等)，在室溫或37℃染色30min，切片置入能保持潮濕的染色盒內，防止干燥。
2．洗片 傾去存留的熒光抗體，將切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗兩次，攪拌，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結晶。
3．用50%緩沖（0.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0～9.5)甘油封固、鏡檢
4．對照染色
①正常免熒光血清染色，如上法處理切片，結果應為陰性。②染色抑制試驗（一步法)：將熒光抗體和未標記的抗體球蛋白或血清（相同)等量混合，如上法處理切片。結果應為陰性。為證明此種染色抑制不是由于熒光抗體被稀釋所致，可用鹽水代替未標記抗血清，染色結果應為陽性。此法結果較二步法穩(wěn)定。③類屬抗原染色試驗，前面已作敘述。
直接法比較簡單，適合做細菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質抗原如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應的抗原，特異性高而敏感性較低。
�。ǘ�)間接法
（1)切片固定后用毛細滴管吸取經(jīng)適當稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度，37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗兩次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液體。
�。�2)再滴加間接熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體等)，同上步驟，染色30min，37℃，緩沖鹽水洗兩次10min，攪拌，緩沖甘油封固，鏡檢。醫(yī)學全.在.線m.52667788.cn
對照染色：①抗體對照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法進行染色，結果應為陰性。②抗原對照：即類屬抗原染色，亦應為陰性。③陽性對照。
間接法中上述方法稱雙層法（Double Layer Method)。另一種稱夾心法，即用未標記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應抗體結合，再用該抗原之熒光抗體重疊結合其上，而間接地顯示出組織和細胞中抗體的存在，方法步驟如下：
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�、诘渭游礃擞浀奶禺愋钥乖饔们衅�37℃，30min。
�、劬彌_鹽水洗2次，每次5min，吹干。
�、艿渭犹禺愋詿晒饪贵w再用切片于37℃，30min。
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�、蘧彌_甘油封固，鏡檢。
間接法只需制備一種熒光抗體可以檢出多種抗原，敏感性較高，操作方法較易掌握，而且能解決一些不易制備動物免疫血清的病原體（如麻疹)等的研究和檢查，所以已被廣泛應用于自身抗體和感染病人血清的試驗。
