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原位分子雜交技術(shù)在電鏡水平的應(yīng)用

  自Gall和Pardue建立了原位雜交技術(shù)以來(lái)近20余年內(nèi),這一技術(shù)為基因的定位和表達(dá)、基因進(jìn)化、發(fā)育生物學(xué)、腫瘤學(xué)、微生物學(xué)、病毒學(xué)、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和遺傳分析等領(lǐng)域研究提供了極其寶貴的資料,發(fā)揮了其它技術(shù)難以取代的作用。近年來(lái),此一技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域逐漸擴(kuò)大并在兩個(gè)主要進(jìn)行了技術(shù)法的改進(jìn)。一方面是應(yīng)用一系列放大手段增強(qiáng)檢測(cè)的靈敏度(詳見(jiàn)二十二章 ),另一方面是提高其分辨率,即向電鏡水平發(fā)展。Jacob(1971)首先用3H標(biāo)記的核酸RNA探針與DNA雜交并在電鏡水平顯示獲得成功,繼后不少科技工作者在這方面做了大量的工作(Manning et al 1975,Steinert et al 1976,Hutchison et al 1982)。但所應(yīng)用的均是同位素標(biāo)記核酸探針,直到1986年Binder首先用生物素標(biāo)記的rDNA及UI探針,在蜂蠅(Drosophila)卵巢,應(yīng)用Lowicryl-K4M低溫包埋的切片上進(jìn)行原位分子雜交,以蛋白A和膠體金復(fù)合物作為顯示系統(tǒng),較好的保存了組織的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)和較高的信噪比例。Webster等人(1986)應(yīng)用生物素標(biāo)記探針顯示了細(xì)胞內(nèi)mRNA的分布。Singer等(1989)成功的用雙標(biāo)記原位雜交技術(shù),一方面檢測(cè)整裝抽提細(xì)胞內(nèi)與骨架結(jié)合的mRNA,同時(shí)顯示了該mRNA所表達(dá)的蛋白質(zhì)。新近Fischer等利用地高辛標(biāo)記rRNA探針在Lowicryl-K4M包埋的切片進(jìn)行雜交,然后以抗地高辛等抗體結(jié)合膠體金顆粒進(jìn)行顯示,以銀顯示法加強(qiáng)獲得極為滿(mǎn)意的定位。總之,電鏡水平的原位分子雜交技術(shù)在國(guó)外還處在不斷提高和改進(jìn)的階段,在國(guó)內(nèi)此一技術(shù)還剛起步。焦仁杰等(1992)報(bào)告了以生物素標(biāo)記腺病毒的基因組探針與整裝抽提的細(xì)胞進(jìn)行電鏡原位雜交技術(shù),成功地證明了腺病毒DNA與核骨架的緊密結(jié)合關(guān)系,膠體金顆粒呈簇狀與串珠狀結(jié)合在核骨架上。向正華等(1994)應(yīng)用地高辛標(biāo)記探針結(jié)合HRP的包埋前染色法顯示了POMc mRNA定位于神經(jīng)元的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。下面列舉幾種代表性的電鏡原位雜交技術(shù)。

  一、應(yīng)用同位素標(biāo)記cRNA探針電鏡原位雜交技術(shù)于染色體制片(Hutchison et al, 1982)

  (1)將整封染色體鋪片放置于金網(wǎng)上,在70%的酒精蒸汽固定4~15h,空氣干燥。

  (2)以強(qiáng)堿使DNA變性,將金網(wǎng)置于2×SSC內(nèi)(應(yīng)用0.1n NaOH調(diào)整至pH12),室溫,2min。

  (3)脫水,以70%和95%酒精各沖洗3次,空氣干燥。

 �。�4)雜交,金網(wǎng)覆于平面玻璃皿( Petri dish)內(nèi)的雜交液滴上,每滴約10~15μl,將此小碟置于盛于雜交緩沖的大塑料盒內(nèi),保持濕潤(rùn),在60~65℃孵育4~24h。

  雜交液的配制:6×SSC或6×TNS(1×TNs =0.1mol/L NaCl, 0.01mol/L Tris,Ph6.8,含30000~50000cpm/10μl 3h cRNA)。

  (5)雜交后沖洗,金網(wǎng)自雜交液中取出后立即用大量的2×SSC沖洗多次。RNA酶溶液(20μg/ml)室溫沖洗,然后再用2×SSC室溫沖洗,沖洗后梯度酒精脫水(70%,95%)空氣干燥。

 �。�6)浸入乳膠膜,應(yīng)用L-4核乳膠液,水稀釋4倍。浸膜后的金網(wǎng),用膠帶固定在載玻片上放在密封的黑色塑料盒內(nèi),4℃,時(shí)間根據(jù)同位素種類(lèi)和靶mRNA含量而定,也可選擇不同時(shí)間曝光,根據(jù)顯影強(qiáng)弱確定最終顯影的時(shí)間。

  (7)顯影。暗盒自冷房或冰箱中取出后,在室漸中回暖至少30min,以防核乳膠膜皺縮。然后在顯影液(Kodax Microdol X)顯影3~5min,溫度18~24℃。水沖,在15% Kodax快速定影液定影5min,然后在空氣中干燥。

  所有溶液應(yīng)盡可能新鮮配制。

 �。�8)電鏡觀察。

  二、應(yīng)用生物素標(biāo)記DNA探針電鏡原位雜交技術(shù)

 �。ㄒ�)基本原理

  應(yīng)用DNA探針缺口翻譯(nick translation)方法,通過(guò)堿基配對(duì)以一條DNA鏈為模板,將生物素標(biāo)記的某一種脫氧三磷酸核苷酸如Bio-dUTP滲入有缺口的DNA鏈。將生物素標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞或組織進(jìn)行原位雜交。顯示方法有二種:一種是用HRP顯示,類(lèi)似免疫電鏡技術(shù)中采取的包埋前染色法,利用地高辛-過(guò)氧化物酶HRP顯色法進(jìn)行光鏡水平的厚片原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)染色,其步驟與第二十章 敘述的原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)基本方法相同,只是為了減少細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)的損傷,在包埋過(guò)程中減少H2O2和Triton X-10等易損傷細(xì)胞與組織結(jié)構(gòu)的試劑用量(向正華等1993)。在顯色完畢后,取反應(yīng)陽(yáng)性部位按常規(guī)電鏡操作程序進(jìn)行鋨酸后固定,脫水,包埋,切片和觀察。此法利用HRP免疫反應(yīng)產(chǎn)物具有極高電子反應(yīng)密度體積大小不一,加之非特異性反應(yīng)產(chǎn)物常掩蓋微細(xì)結(jié)構(gòu)的背景,不易達(dá)到準(zhǔn)確的定位�,F(xiàn)在比較廣泛應(yīng)用的是生物素-蛋白A(PA)膠體金(gold)標(biāo)記技術(shù)。用于原位雜交的電鏡定位,取得較為滿(mǎn)意的效果。其基本原理是利用生物素標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織進(jìn)行原位雜交后,利用抗生物素抗體-結(jié)合蛋白A-金標(biāo)記雜交體的超微結(jié)構(gòu)定位,類(lèi)似免疫電鏡中的包埋后染色。在包埋劑應(yīng)用方面,有報(bào)告應(yīng)用環(huán)氧樹(shù)脂包埋獲得成功的。但大多數(shù)較滿(mǎn)意的結(jié)果均獲自低溫親水性包埋劑——Lowicryl-K4M,也有應(yīng)用LR-white作為包埋劑的(詳見(jiàn)第七章 )。

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