免疫學(xué)實驗指導(dǎo)-實驗二 免疫標記技術(shù)

第二部分  免疫標記技術(shù)

免疫標記技術(shù)(immunolabellingtechniques)是用特定的物質(zhì)標記抗原或抗體進行的抗原抗體反應(yīng)。可借助各種儀器觀察結(jié)果或進行自動化測定，可在細胞、亞細胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上，對抗原抗體反應(yīng)進行定性和定位研究；或應(yīng)用各種液相和固相免疫分析方法，對液體中的抗原、半抗原或抗體進行定性和定量測定。由于標記物的應(yīng)用，免疫標記技術(shù)在特異性、敏感性、精確性及應(yīng)用范圍等方面大大優(yōu)于一般的免疫血清學(xué)方法。

實驗一  酶免疫技術(shù)

酶免疫技術(shù)是以酶作為標記物的免疫測定方法，利用酶的高效催化作用提高檢測的敏感度。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要分離結(jié)合的與游離的酶標記物，酶免疫技術(shù)分為均相和異相，醫(yī)學(xué)檢驗中常用的酶免疫技術(shù)均為異相。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay， ELISA)是一種用酶標記抗原或抗體檢測相應(yīng)抗體或抗原的方法。此法將抗原、抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶促反應(yīng)的專一性、敏感性有機地結(jié)合起來，可檢測體液中微量的特異性抗原或抗體。本方法具有敏感性高、特異性強、操作簡單、易觀察結(jié)果、便于大規(guī)模檢測等特點，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的許多領(lǐng)域。主要有雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、競爭抑制法、中和法等模式。本實驗介紹在乙肝“兩對半”檢測中應(yīng)用的酶聯(lián)免疫吸附試驗間接法和雙抗體夾心法。

一、間接法(間接ELISA)

 【原理】

  將抗原結(jié)合在微量滴定板上，利用酶標記的抗抗體來檢測標本中與滴定板上抗原結(jié)合的抗體，形成抗原－抗體－酶標抗抗體復(fù)合物，再加入酶特異性底物，即可出現(xiàn)顏色反應(yīng)。該法是檢測抗體最常用的方法之一，它的優(yōu)點是制備出一種酶標抗體，就可適用多種抗原抗體對的檢測。

 【材料】

  1．抗原  乙肝疫苗(含HBsAg)。

  2．抗體  以含有和不含有抗HBs的IgG 的人血清分別作為陽性和陰性對照血清，另取待檢者血清為待測血清。

  3．酶標抗抗體(二抗)  辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG抗體(HRP－羊抗人IgG抗體)。

  4．試劑  包被液：pH 9.6 碳酸鹽緩沖液；洗滌液：含0.5％吐溫-20的pH7.4、0.02M 磷酸鹽緩沖液；稀釋液：pH7.4、0.02M 磷酸鹽緩沖液；底物液：10ml pH 5.0磷酸－枸櫞酸緩沖液加入鄰苯二胺4mg、30％H₂O₂ 5μl；終止液：2M H₂SO₄。

  5．酶標檢測儀、微量加樣器、微量滴定板等。

   【方法】

 1．包被  用包被液稀釋乙肝疫苗抗原至預(yù)試驗確定的工作濃度，加入聚苯乙烯微量滴定板中，每孔100μl；設(shè)正�？乖瓕φ�，4℃過夜。

  2．洗滌  用洗滌液洗滌3次，每次3min，甩凈，拍干。

  3．加血清  取待檢血清，加入滴定孔中，每孔100μl，同時設(shè)陰、陽性及空白對照。37℃孵育1.5～2h，洗滌3次，方法同上。

  4．加酶標抗抗體  稀釋酶標抗抗體至工作濃度，每孔加100μl，37℃1h，洗滌3次。

  5．加底物  每孔加底物液50μl，37℃避光孵育30min后，加2M H₂SO₄終止反應(yīng)，每孔50μl。

  【結(jié)果】

1．目測法  與陽性和陰性對照比較，觀察顏色深淺作出判斷(陽性呈棕黃色)。

2．測吸光值(A值)  用酶標檢測儀測定各孔A值，以P/N≥2.1為陽性，P/m.52667788.cnN＜2.1而≥1.5為可疑，P/N＜1.5為陰性。

    待測孔A值－空白孔A值

P/N值＝

陽性對照孔A值－空白孔A值

   【注意事項】

1．各種試劑最好臨用前用新鮮的雙蒸水或三蒸水配制。

2．加樣最好使用定量準確的微量加樣器，將液體加在孔底，避免加于孔壁上方，防止氣泡產(chǎn)生。

3．目測法易受主觀因素影響，檢測吸光值法受儀器質(zhì)量和ELISA板質(zhì)量的影響。

4．每次試驗設(shè)陽性血清、陰性血清、酶標抗抗體及空白對照。

5．不同的商品試劑盒結(jié)果判斷值各異，應(yīng)仔細閱讀說明書。

二、雙抗體夾心法

   【原理】

與間接法基本相同，不同之處在于包被特異性抗體，加待測抗原孵育后，再加入酶標記的相同抗體，形成抗體－抗原－酶標抗體復(fù)合物，最后通過酶與特異性底物相互作用，出現(xiàn)顏色反應(yīng)，根據(jù)顏色深淺，可判斷抗原量的多少。是檢測抗原常用的方法，但需針對不同抗原制備不同的酶標抗體。

   【材料】

1．抗原  以含有和不含有HBsAg的人血清分別作為陽性和陰性對照血清。

2．抗體  抗HBs。

3．酶標抗體  辣根過氧化物酶標記的抗HBs。

4．其它試劑、器材同間接法。

   【方法】

1．包被  用包被液將抗HBs稀釋至工作濃度，加入聚苯乙烯微量滴定板中，每孔100μl，4℃過夜。

2．洗滌  用洗滌液洗滌3次，每次3min，甩凈，拍干。

3．加待測抗原  稀釋待檢血清，加入滴定孔中，每孔100μl，同時設(shè)陰、陽性對照。37℃孵育1.5～2h，洗滌3次，方法同上。

4．加酶標HBs抗體  稀釋酶標抗體至工作濃度，每孔加100μl，37℃1h，洗滌3次。

5．加底物  每孔加底物液50μl，37℃避光孵育30min后，加2M H₂SO₄終止反應(yīng)，每孔50μl。

  【結(jié)果】

判斷與間接法相同。

   【注意事項】

同間接法

   【思考題】

1．酶聯(lián)免疫吸附試驗間接法和雙抗體夾心法的原理是什么？

2．為什么說“洗滌”是一個關(guān)鍵步驟？洗滌不徹底有什么影響？洗滌的目的是什么？

實驗二  免疫熒光技術(shù)

   免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence technique)是以熒光物質(zhì)作為標記物，與已知的抗體(或抗原)結(jié)合，但不影響其免疫學(xué)特性，根據(jù)熒光的存在與否來檢測抗原或抗體。該技術(shù)多用于抗原的定性與定位，在熒光顯微鏡下可以直接觀察呈現(xiàn)特異熒光的抗原抗體復(fù)合物及其存在部位；也可與標準品對照而得到分析物的濃度而進行定量。

一、直接免疫熒光法檢測B細胞的mIg

【原理】

B細胞表面攜帶的mIg，為B細胞的特異性表面標志，能與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，故可用熒光標記的抗全Ig血清作免疫熒光染色鏡檢。由于B細胞在分化過程中的每個階段均具有Ig的標志，故該法可檢出全部B細胞。每一個B細胞表面可攜帶不同類Ig，即mIgM、mIgD、mIgG、mIgA或mIgE，如分別用單價熒光抗Ig血清染色，則可鑒別帶不同類Ig的淋巴細胞。人外周血B細胞以攜帶IgM為主。凡與熒光標記抗體結(jié)合的細胞，在熒光顯微鏡下細胞膜可呈現(xiàn)熒光，即為mIg陽性細胞，也就是B淋巴細胞。同時用普通光源照明，計數(shù)該視野的淋巴細胞總數(shù)，根據(jù)發(fā)熒光與不發(fā)熒光細胞的計數(shù)，可計算出mIg陽性細胞或帶各類mIg細胞的百分數(shù)。

直接免疫熒光法的優(yōu)點為：⑴由于在反應(yīng)中只有兩種因子參與，結(jié)果判斷較簡單；⑵特異性強，與其他抗原交叉染色較少；⑶操作步驟少，方法簡便、省時。其缺點有：⑴敏感性較差；⑵一種標記抗體只能鑒定一種抗原；⑶不能用于鑒定未知抗體。

【材料】

1．試劑  熒光標記的兔或羊抗人Ig血清、受檢者靜脈抗凝血、RPMI1640完全培養(yǎng)液、5%小牛血清Hanks液、淋巴細胞分離液（比重1.077±0.001)、0.2%臺酚藍染液。

 2．器材  清潔載玻片、蓋玻片、血球計數(shù)板、計數(shù)器、毛細吸管、試管、顯微鏡、熒光顯微鏡。

【方法】

1．取靜脈抗凝血4ml，加入Hanks液4ml，混勻后用毛細吸管滴加于已裝有4ml聚蔗糖泛影葡胺淋巴細胞分離液面上(在1.5×15cm試管內(nèi))，立即2000rpm20min，棄去上清液后再用Hanks液洗滌一次，棄上清，用RPMI1640完全培養(yǎng)液懸浮細胞，計數(shù)白細胞數(shù)，并用0.2%臺酚藍染液測細胞活力，活細胞數(shù)應(yīng)大于95%。用RPMI1640完全培養(yǎng)液將細胞懸液配成5×10⁶/ml。

2．在試管中加入配制好的淋巴細胞懸液0.1ml，再加入熒光抗體0.1ml，放置4℃作用30min。

3．加已37℃預(yù)溫的含5%小牛血清Hanks液2～3ml，離心1500rpm ，10min。如此重復(fù)洗滌2次。

4．取沉淀細胞滴加在載玻片上，覆以蓋玻片，置熒光顯微鏡暗視野下觀察。

【結(jié)果】

一般先用暗視野計數(shù)熒光陽性細胞數(shù)，繼用普通光源計數(shù)同一視野中淋巴細胞總數(shù)。每份標本計數(shù)200個淋巴細胞，著熒光者為B細胞，計算其百分率，同時按原血標本中淋巴細胞的總數(shù)計算B淋巴細胞的絕對值。

免疫熒光染色細胞的形態(tài)和類型：凡呈現(xiàn)微弱、均勻一致的暗淡熒光者為非B細胞；凡細胞呈現(xiàn)較強熒光，有明顯的細胞輪廓，并可見環(huán)狀或兩個以上斑點或在細胞的一側(cè)見有帽狀結(jié)構(gòu)的為mIg陽性細胞—B細胞。

正常值：正常人外周血中mIg陽性細胞均值±SD為11.2±1.5%。

二、間接免疫熒光法檢測痢疾桿菌

間接免疫熒光法是目前最常用的方法。首先用已知未標記的抗體(第一抗體)與待檢抗原反應(yīng)或用未知抗體與已知抗原反應(yīng)，反應(yīng)一定時間后，洗去未結(jié)合的抗體，再與標記的抗免疫球蛋白(二抗)反應(yīng)。在第一步反應(yīng)中，若抗原抗體發(fā)生了反應(yīng)，則抗體被固定在標本上，那么第二步反應(yīng)中標記的抗體(二抗)則可與第一步反應(yīng)形成的抗原抗體復(fù)合物中的抗體發(fā)生反應(yīng)，這樣可以通過二抗的示蹤，對標本中未知抗原或抗體進行鑒定。其優(yōu)點為：⑴ 敏感性較高，是直接法的5～10倍；⑵用一種標記抗抗體，就能與一種以上的相應(yīng)抗體配合，鑒定多種未知的抗原或抗體；⑶既能鑒定未知抗原，又能鑒定未知抗體。其缺點有：⑴在反應(yīng)中有多種因子參與，容易產(chǎn)生非特異性染色，結(jié)果判斷有時較困難；⑵操作步驟多，費時。

本試驗用已知抗福氏痢疾桿菌IgG與待檢抗原反應(yīng)，一定時間后，洗去未結(jié)合的抗體，再與標記的抗IgG抗體反應(yīng)。通過觀察熒光有無鑒定細菌是否為福氏痢疾桿菌。

【材料】

1．滅活的福氏痢疾桿菌、滅活的傷寒桿菌。

2．一抗(兔抗福氏痢疾桿菌IgG)、熒光標記的二抗(羊抗兔IgG抗體)。

3．固定劑：4％多聚甲醛、乙醇等。

4．洗滌液和抗體稀釋液(pH7.4 PBS-Tween 20)。

  【方法】

1．將滅活的福氏痢疾桿菌、傷寒桿菌固定在載玻片上。

2．加入25μl一抗，完全覆蓋住玻片上細菌，室溫孵育60min；每個檢測應(yīng)包括3組對照：與一抗同一種屬、類型的無關(guān)抗體組，以檢測染色的特異性；未加一抗的對照組，以檢測二抗染色的背景；如果可能，用已知陽性樣品作為陽性對照組。

3．用洗滌液洗3次，各5min。加入FITC(異硫氰酸熒光素)標記的抗抗體(二抗)25μl，室溫孵育20min；標記二抗在使用前，應(yīng)預(yù)試其合適的稀釋度。

4．用洗滌液洗3次，各5min。

5．在作好標記的載玻片上滴一滴固定劑(約50μl)，蓋上蓋玻片并在空氣中干燥30min。

6．在熒光顯微鏡下觀察、拍照。

   【結(jié)果】

熒光顯微鏡觀察，見到發(fā)出明顯熒光的桿狀細菌為福氏痢疾桿菌。

【注意事項】

1．一抗二抗使用前均應(yīng)測試其合適的稀釋度。

2．防止抗體污染出現(xiàn)假陽性。

3．每次試驗前熒光抗體需3000rpm30min，以除去熒光血清中的聚合蛋白。

【思考題】

1．直接免疫熒光法、間接免疫熒光法的原理是什么？

2．直接免疫熒光法和間接免疫熒光法各有何優(yōu)缺點？ 

實驗三  放射免疫分析技術(shù)

  【原理】

放射免疫分析技術(shù)(radioimmunoassay，RIA)一般采用競爭結(jié)合分析技術(shù)。其基本原理為同位素標記的抗原(Ag^*)與待測抗原(或標準品)競爭性結(jié)合有限的特異性抗體，最終形成的Ag^*-Ab復(fù)合物的量與被測物的含量呈負相關(guān)。當(dāng)抗體的量固定不變時，免疫復(fù)合物的形成就受到待測抗原量的制約。如反應(yīng)體系中待測抗原含量高時，對Ab的競爭結(jié)合能力就強，Ag-Ab復(fù)合物的形成量就會增加，Ag*-Ab復(fù)合物則相對減少；反m.52667788.cn/shouyi/之，當(dāng)待測抗原含量低時，對Ab的競爭結(jié)合能力弱，Ag*-Ab復(fù)合物的形成量即增多。

  Ag*(標記抗原)＋Ab(特異性抗體) Ag*-Ab(標記抗原抗體復(fù)合物)

 ＋

Ag(未標記抗原)

   Ag-Ab(未標記抗原抗體復(fù)合物)

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)在胎兒生長發(fā)育過程中由卵黃囊和肝細胞合成，胃腸管細胞也可合成一部分。出生后逐漸減少，在成人血清中含量極微。原發(fā)性肝細胞性肝癌時AFP明顯增高，可通過檢測其含量協(xié)助臨床診斷。

本試驗將純化¹²⁵I標記的AFP與樣本內(nèi)AFP混合，使二者競爭結(jié)合一定數(shù)量AFP抗體，經(jīng)處理后用γ計數(shù)儀計數(shù)¹²⁵I標記的AFP與抗體結(jié)合的數(shù)量。

   【材料】

1．¹²⁵I-AFP、AFP標準品。

2．AFP抗體(第一抗體)、第二抗體(兔抗人Ig)。

3．待測人血清、緩沖液。

4．免疫反應(yīng)管、微量加樣器、γ-射線閃爍計數(shù)器等。

   【方法】

1．  按表2-1加入各反應(yīng)液于免疫反應(yīng)管中，每份樣品均作雙份測定。

2．反應(yīng)  先將反應(yīng)管37℃溫育30min，再放4℃24h。

3．B、F的分離

　�、� 自4℃取出后加入第二抗體0.1ml/管，室溫放置4h；

　�、� 離心3000rpm，15min，沉淀物為已結(jié)合的AFP抗原(B)，游離的AFP抗原(F)留在上清液中棄去。

　　4．測定

　�、� 各反應(yīng)管加第二抗體后未離心之前測定總放射性；

　�、� 離心棄去上清后，再測定沉淀物的放射性。

表2-1 AFP放射免疫分析加樣程序

    5．計算各管的百分結(jié)合率

對照管(Bc)的非特異性結(jié)合率：Bc＝Bc / (B+F)c×100％

標準品管的百分結(jié)合率：B＝B/ (B+F) ×100％－Bc

樣品管(Bs)的百分結(jié)合率：Bs＝Bs / (B+F)s ×100％－Bc

6．繪制標準曲線  以標準AFP含量為橫坐標，標準管百分結(jié)合率為縱坐標繪圖。

7．計算樣品AFP含量。

   【結(jié)果】

通常健康成人血清含微量AFP，其值低于25ng/ml。樣本結(jié)果＜20ng/ml者，可基本排除原發(fā)性肝癌的可能性；介于100～350ng/ml之間者，必須進行隨訪，密切觀察AFP的動態(tài)變化；350～500ng/ml或含量有明顯增高者，必須參考其他實驗結(jié)果并高度警惕原發(fā)性肝癌的可能；500～1000ng/ml且AFP含量在短期內(nèi)不斷升高，原發(fā)性肝癌可能性很大，建議作活檢；＞1000ng/ml，且近期內(nèi)含量迅速升高，結(jié)合臨床可基本診斷為原發(fā)性肝癌。

   【注意事項】

1．RIA測定AFP的范圍為0～400ng/ml，最敏感段為0～100ng/ml，故受檢血清AFP高于400ng/ml時應(yīng)進行稀釋。

2．各種抗原抗體試劑應(yīng)儲存于2～10℃，禁忌冰凍。

3．第二抗體加入反應(yīng)管溫育后，用肉眼檢查反應(yīng)液呈明顯絮狀沉淀時才能進行離心分離，否則需延長溫育時間或增加第二抗體量。

4．嚴重溶血標本不能使用；血脂會使結(jié)果偏高，宜空腹采血。

5．¹²⁵I具有放射性，操作人員應(yīng)注意防范。廢棄物應(yīng)按有關(guān)規(guī)定存放。

   【思考題】

1．RIA的原理是什么？該試驗主要應(yīng)用于哪些方面？。

2．試比較RIA、ELISA以及熒光標記技術(shù)的優(yōu)缺點。

實驗四  膠體金技術(shù)

膠體金免疫結(jié)合試驗是在酶免疫結(jié)合試驗的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種固相標記免疫測定新技術(shù)。其特點是單份測定，簡單、快速。除商品試劑外不需任何儀器設(shè)備，幾分鐘即可用肉眼觀察結(jié)果。目前已在臨床檢測中獲得廣泛應(yīng)用。

 氯金酸(HAuCl₄)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金標記，實質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理可能是膠體金顆粒表面負電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團因靜電吸附而牢固結(jié)合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑，也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對蛋白質(zhì)有很強的吸附作用，可以與葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白、多肽等非共價結(jié)合，因而在基礎(chǔ)研究和臨床實驗中成為非常有用的工具。免疫金標記技術(shù)(Immunogold labellingtechique)主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當(dāng)這些標記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測中。這一反應(yīng)也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。

下面以斑點金免疫結(jié)合試驗為例對金標記技術(shù)的應(yīng)用作簡要敘述。本組試驗以膠體金為標記物，以硝酸纖維素(NC)膜為固相載體，按間接法、雙抗體夾心法等反應(yīng)模式，通過滲濾或滲移方式完成免疫測定過程。該法可用于檢測抗原或抗體，最大特點是簡便快速。

一、 斑點金免疫滲濾試驗

  【原理】

斑點金免疫滲濾試驗(Dot-immunogold filtration assay，DIGFA)，又稱滴金免疫法，分間接法或夾心法。間接法測抗體：固定于膜上的特異性抗原＋標本中的相應(yīng)抗體＋金標記的抗抗體或SPA顯色。夾心法測抗原：固定于膜上的多克隆抗體＋標本中待測抗原＋金標記的特異性單克隆抗體顯色。以雙抗體夾心法測定人尿中HCG為例。選取二株抗HCG不同決定簇的抗體，其中一個用膠體金標記，另一抗體吸附于NC膜表面形成斑點，膜下面墊有吸水材料。標本經(jīng)濾膜板除雜質(zhì)后，標本液經(jīng)NC膜滲濾，膜上抗體捕獲HCG，形成免疫復(fù)合物。之后加入抗HCG免疫金結(jié)合物形成特異性雙抗體夾心物。此時膠體免疫金顏色的深淺與標本中HCG含量呈正相關(guān)。

   【材料】

1．標本　孕婦尿。

2．試劑 參照標準液(HCG 50mU／m1)、膠體免疫金結(jié)合物、洗滌液(pH7.2 ，0.02mM PBS)。

3．器材包被抗HCG抗體的滲濾反應(yīng)板、試管、微量移液器等。

【方法】

  1．取滲濾反應(yīng)板，平放于實驗臺面，于滴孔下分別標明“S”和“C”。

 　 2．在“C”孔內(nèi)滴加參照標準液6滴，在“S”孔內(nèi)滴加尿液標本6滴，待完全滲入后，移去孔上濾膜板。

3．每孔加膠體免疫金結(jié)合物液3滴于NC膜上，應(yīng)完全滲入到NC膜中。

4．每孔加洗滌液3滴，待完全滲入后，目測觀察結(jié)果。

圖2-1 DIGFA滲濾裝置

【結(jié)果】

1．參照標準液孔膜上應(yīng)有清晰的淡紅色斑點出現(xiàn)。

2．若標本滴加孔膜上無紅色斑點，或斑點顯色淺于參照標準液孔，說明標本中HCG含量低于50mU／ml；如標本孔斑點深于參照孔，則標本中HCG含量大于50mU／ml。

3．若測定標本為強陽性時，可用洗滌液稀釋，按同法作測定，稀釋至標本斑點與參照孔顏色相當(dāng)，即可知標本HCG含量(50mU／ml×稀釋倍數(shù))。

正常未妊娠婦女尿中不含HCG，或其含量上限為50mU／ml。HCG由胎盤滋養(yǎng)層細胞分泌，為分子量47000的糖蛋白。孕婦妊娠1周后，尿中HCG迅速升高，呈陽性反應(yīng)。停經(jīng)后8周左右尿內(nèi)激素含量達到最高，以后逐漸減低，直至轉(zhuǎn)為陰性。絨毛膜上皮癌、水泡狀胎塊和睪丸畸胎瘤病人的尿中，HCG均可呈強陽性反應(yīng)。

   【注意事項】

1．本試驗為對比測定法，參照標準液與標本的加入量應(yīng)盡量一致。

    2．膠體免疫金結(jié)合物滴加時，滴瓶應(yīng)垂直向下，液滴內(nèi)不含氣泡。

二、斑點金免疫層析試驗

   【原理】

斑點金免疫層析試驗(dot immunogoldchromatographic assay，DIGCA)，又稱“一步金法”。以測定尿HCG為例，采用雙抗體夾心法。將抗HCG單抗和抗小鼠IgG抗體分別固化于NC膜上，形成測試斑點線和質(zhì)控參照斑點線�？笻CG免疫金結(jié)合物干片緊貼NC膜下端，試紙條兩端附有吸水材料。當(dāng)試紙條下端吸取標本后，液體向上移滲，流經(jīng)干片時，標本中HCG與免疫金結(jié)合物形成復(fù)合物。復(fù)合物沿NC膜的毛細微孔向前滲移至測試線時，形成雙抗體夾心復(fù)合物，出現(xiàn)紅色反應(yīng)線條。剩余免疫金結(jié)合物繼續(xù)滲移至質(zhì)控參照線，與抗小鼠單抗結(jié)合呈現(xiàn)出紅色質(zhì)控線條。多余液體繼續(xù)向前滲移至試紙條上端的吸水物內(nèi)。本試驗最大特點是所有試劑均干化，操作十分簡便。

圖2-2  DIGCA層析裝置

左：正面圖　　　　右：縱切面圖

1.吸水濾紙　　　  2.固定有抗α-HCG抗體的NC膜

3.凍干金標記的抗α-HCG的玻璃纖維 　4.吸水材料

5.試劑質(zhì)控區(qū)帶　   　6.固定的抗α-HCG抗體區(qū)帶

7.硬質(zhì)塑料板

  【材料】

1．標本　孕婦尿。

2．主要試劑  “一步金法”早早孕妊娠診斷紙條片。

3．主要器材　尿液收集杯等。

【方法】

  將試紙條下端標志部插入尿液中l(wèi)0s左右，取出后放平，置室溫下3min，目測觀察結(jié)果。

 【結(jié)果】

  若出現(xiàn)二條紫紅色線為HCG陽性，若只有質(zhì)控參照線顯示紫紅色為HCG陰性(未妊娠)。該法檢測的靈敏度為50mU/ml。

 【注意事項】

 1．強陽性尿中HCG含量高，可能不出現(xiàn)質(zhì)控線或很淺，而僅在反應(yīng)區(qū)顯示淡紫色條帶。

 2．試紙條不宜插入尿液過深或過淺，插入時間也不宜過長或過短。

 3．孕婦妊娠1周后，尿夜中就能檢出HCG，可進行早期診斷。

 4．絨毛膜上皮癌、水泡狀胎塊和睪丸畸胎瘤病人尿HCG含量可明顯增高，應(yīng)結(jié)合臨床癥狀區(qū)別。

 【思考題】

1．什么是快速斑點免疫金結(jié)合試驗，有哪些類型？

2．實驗操作過程中應(yīng)注意什么？

3．尿液HCG陽性有何臨床意義？