實驗八 動物實驗技術(shù)
實驗動物常用作病原微生物的分離和鑒定，進行動物接種實驗應(yīng)選擇易感性高、健康的動物。常用的動物有小鼠、豚鼠和家兔。根據(jù)實驗要求可通過皮下、皮內(nèi)、肌肉、腹腔、靜脈等途徑注射。感染動物死亡后，必要時進行尸體解剖并作病原體的檢查。
一、實驗動物接種法
（一)小白鼠接種法
【材料】
1．小白鼠。
2．無菌注射器(1ml)及針頭。
3．碘酒、75%酒精、接種物。
【方法】
1．皮下注射法：一般注射于腹部。
(1) 用注射器吸取接種物。
(2) 小白鼠固定法：用右手拇指和食指捏住小鼠尾部，使它在桌上向前爬行，輕輕向后拉鼠尾(圖8-1)，再用左手食指及拇指捉住其兩耳及頸部皮膚，將手反轉(zhuǎn)，使小白鼠腹部向上，把小白鼠尾巴和左腿夾于左手小指和手掌之間(圖8-2)。
(3) 用碘酒及酒精消毒腹部皮膚，針頭稍平刺入皮下，注入接種物0.2～0.3ml，如局部有隆起表示已注入，注射后局部再次消毒(圖8-3)。
2．腹腔注射法：常注射于下腹部白線稍左或稍右部位，固定方法同上。注射時先將針頭平刺于皮下，然后稍抬起針頭刺人腹腔中，注射接種物0.5ml(圖8-4)。
3、肌肉注射法：多注射于肌肉發(fā)達，無大血管經(jīng)過的部位，如后腿肌肉，將針頭直刺入肌肉深層，注射量不超過0.2ml。
4．腦內(nèi)注射法：將標(biāo)本接種幼齡鼠(體重l0g左右)腦內(nèi)(從眼內(nèi)眥與鼻根部之間刺入)，用左手拇指食指固定頭部，注射量不超過0.1ml。
圖8-1 小鼠抓持方法圖8-2 小鼠徒手固定方法
圖8-3 小鼠皮下注射示意圖圖8-4 小鼠腹腔注射示意圖
（二)家兔接種法
【材料】
1．家兔。
2．無菌注射器和針頭。
3．碘酒、75%酒精、接種物。
【方法】
1．皮內(nèi)注射法：皮內(nèi)注射多為觀察皮膚反應(yīng)，所以注射前應(yīng)將局部毛剪去。常注射在背部。注射局部消毒后，將針頭的針孔向上平刺皮層內(nèi)，注射物推入后，如局部隆起，其上毛孔明顯，即表示注入。注射量不超過0.1ml。
2．靜脈注射法：多采用外耳緣靜脈注射(圖8-5)。
(1) 將家兔放入固定盒固定好，拔去注射部位的毛，局部消毒，手指輕彈兔耳使血管擴張。
(2) 針頭經(jīng)皮膚平刺入血管中，回一下血，緩慢注入接種物。
(3) 注射后局部消毒，并用消毒棉球輕壓片刻，以免血液流出。
圖8-5 兔耳緣靜脈注射
二、執(zhí)業(yè)獸醫(yī)接種后動物管理
實驗動物接種后，應(yīng)仔細(xì)管理，以免引起實驗室內(nèi)污染或造成實驗中的誤差，影響實驗結(jié)果。
1．隔離：動物經(jīng)注射感染材料后，應(yīng)與健康動物分開飼養(yǎng)，并在飼養(yǎng)籠上貼標(biāo)簽，注明接種材料、劑量、日期、途徑和接種者姓名，以免混淆。
2．觀察：注射后每日觀察1～2次，注射動物有無異常。
3．測體重、體溫，需要時須每日測體溫。一般動物體溫較人高，現(xiàn)將常用動物正常體溫列于下供參考(肛門測定)。
家兔 38.3～40.8℃
豚鼠 38.6～39.4℃
小白鼠 32.4～38℃
4．動物死亡后，應(yīng)立即進行尸體解剖。不需解剖者，則焚燒或用消毒液浸包后深埋。
三、細(xì)菌致病作用的測定
細(xì)菌的致病力包括侵襲力和毒素。前者是指依靠酶的作用或形成莢膜侵襲機體組織的能力，細(xì)菌所產(chǎn)生的酶有血漿凝固酶、鏈激酶、透明質(zhì)酸酶等。后者有內(nèi)、外毒素2種。
（一)血漿凝固酶試驗(見實驗九)
（二)透明質(zhì)酸酶試驗
【原理】
透明質(zhì)酸是葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖聚合物，是結(jié)締組織基質(zhì)成分。乙型溶血性鏈球菌等產(chǎn)生的透明質(zhì)酸酶可水解透明質(zhì)酸，使結(jié)締組織疏松，通透性增高，使細(xì)菌和毒性物質(zhì)易于擴散，故此酶亦稱擴散因子。
【材料】
1．乙型溶血性鏈球菌肉湯培養(yǎng)濾液(含透明質(zhì)酸酶)、1%美藍液(或黑墨汁)、生理鹽水。m.52667788.cn
2．小試管、lml注射器、6號針頭等。
3．家兔。
【方法】
1．將家兔背部兩側(cè)毛剪除干凈，75%酒精消毒注射部位。
2．將細(xì)菌培養(yǎng)濾液與少許1%美藍液混合，注射0.2ml于家兔一側(cè)皮內(nèi)，為實驗側(cè)。生理鹽水與少許美藍混合，同法注入家兔另一側(cè)皮內(nèi)，為對照側(cè)。注射時避免液體漏出，以免皮膚著色，影響結(jié)果的觀察。
3．2h后，比較兩側(cè)美藍在皮下的擴散范圍。
【結(jié)果】
家兔試驗側(cè)皮下深藍色擴散區(qū)明顯大于對照側(cè)，說明了透明質(zhì)酸酶的作用。
（三)鏈激酶試驗
【原理】
鏈激酶，又稱溶纖維蛋白酶，能水解血漿纖維蛋白，使凝固的血塊溶解，出現(xiàn)液化現(xiàn)象。乙型溶血性鏈球菌及某些金黃色葡萄球菌株可產(chǎn)生此酶，有助于細(xì)菌及毒性產(chǎn)物在感染病灶內(nèi)擴散。
【材料】
1．乙型溶血性鏈球菌肉湯培養(yǎng)物(含鏈激酶)、四聯(lián)球菌肉湯培養(yǎng)物、生理鹽水、枸櫞酸鹽抗凝血、5%氯化鈣液。
2．小試管、1ml注射器、37℃水浴箱等。
【方法】
1．取帶棉塞小試管3支編號①、②、③，各加入抗凝血1ml。
2．于第①、②、③管內(nèi)分別加乙型溶血性鏈球菌培養(yǎng)物、四聯(lián)球菌培養(yǎng)物、生理鹽水各0.5m1。
3．上述3支試管每管加入5%氯化鈣0.2ml，搖勻，置37℃水浴10min，待血液凝固，再繼續(xù)37℃水浴約30min，觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
l．觀察時，可將小試管慢慢傾斜至30°，輕輕搖動。凡凝固血塊又發(fā)生溶解，出現(xiàn)液體者，為鏈激酶試驗陽性，否則為陰性。
2．本試驗①管為陽性，②管為陰性，③管為陰性對照，無液體出現(xiàn)。
（四)莢膜的致病作用
【材料】
1．菌種：Ⅲ型肺炎鏈球菌。
2．小白鼠。
3．無菌lml注射器和針頭。
4．莢膜染色液。
【方法】
1．取20g左右重的健康小白鼠1只，腹腔或皮下注射肺炎鏈球菌菌液0.5m1，飼養(yǎng)觀察
2．待瀕臨死亡時，及時解剖，取血接種血平板，作細(xì)菌培養(yǎng)。
3．取其腹腔液涂片，作莢膜染色鏡檢。
【結(jié)果】
1．有毒力的肺炎鏈球菌，能使小白鼠在12～36h瀕臨死亡。
2．血培養(yǎng)可獲肺炎鏈球菌純培養(yǎng)物。
3．有毒力的肺炎鏈球菌，莢膜染色鏡檢，可見有明顯的莢膜。
四、外毒素的致病作用
【材料】
1．小白鼠。
2．破傷風(fēng)梭菌培養(yǎng)物(破傷風(fēng)外毒素)。
3．無菌lml注射器和針頭。
【方法】
將破傷風(fēng)梭菌接種庖肉培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48h，吸取上清液，3000r/min離心30min，棄去沉渣。臨用時作1∶100稀釋。
1．試驗組：取小白鼠1只，于一側(cè)后腿肌肉注射破傷風(fēng)梭菌濾液0.2～1.0ml。
2．對照組：取1只小白鼠，于一側(cè)肌肉注射破傷風(fēng)抗毒素l00u，30min后，于另一側(cè)肌肉注射0.2～1.0ml破傷風(fēng)桿菌培養(yǎng)濾液。
【結(jié)果】
逐日觀察，實驗組小白鼠的后腿及尾巴強直性痙攣，繼而延及全身，動物全身痙攣，2d內(nèi)死亡。此為毒力試驗陽性。對照組小白鼠仍健康存活。
五、內(nèi)毒素的致病作用
【材料】
1．腦膜炎奈瑟菌內(nèi)毒素。
2．小白鼠。
3．無菌1ml注射器和針頭。
【方法】
1．取腦膜炎奈瑟菌18～24h培養(yǎng)菌液，60℃加熱5～10min，殺死細(xì)菌，成為粗制的內(nèi)毒素。
2．取20g左右重的健康小白鼠1只，將其固定，暴露尾巴，用酒精反復(fù)擦拭，使尾部血管充血。
3．取上述處理的菌液1ml，注入小白鼠尾靜脈。
4．約5h后，用頸椎脫位法殺死小白鼠，解剖觀察。
【結(jié)果】
可見皮下彌散性紫瘢，肝臟淤血水腫，腎臟及腎上腺充血，腸系膜及腹壁血管明顯充血。
