| 實(shí)驗(yàn)一 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
目前，蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法有兩大類：一類是利用蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)，如折射率、比重、染料結(jié)合、紫外吸收等進(jìn)行測(cè)定；另一類是利用化學(xué)方法來測(cè)定蛋白質(zhì)含量，如微量凱氏定氮法、雙縮脲法和Folin-酚試劑法（Lowry法)。這兩類方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，選用何種方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求及實(shí)驗(yàn)室條件進(jìn)行選擇（表2-1)。 表2-1 幾種測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法比較
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p> 本實(shí)驗(yàn)要求掌握幾種常用的測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法；了解這幾種測(cè)定方法的區(qū)別及各自的應(yīng)用。 （一)雙縮脲法 【實(shí)驗(yàn)原理】 雙縮脲（biuret)（H2N－CO－NH－CO－NH2)在堿性溶液中能與銅離子（Cu2+)結(jié)合生成復(fù)雜的紫紅色絡(luò)合物。蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽分子中，含有多個(gè)與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也有雙縮脲反應(yīng)，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。生成的紫紅色絡(luò)合物分子結(jié)構(gòu)為： 實(shí)際上，凡分子內(nèi)含有兩個(gè)氨甲酰基（－CO－NH2)的化合物，不論是直接相連或是通過一個(gè)氮或碳原子間接連接；以及具有一CS－NH2，一C(NH)NH2，－CRH－NH2，－CH2NH－CHNH2CH2OH，－CHOH－CH2NH2等基團(tuán)的化合物均能產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)；甚至過量的銨鹽也會(huì)干擾反應(yīng)。所以，雙縮脲反應(yīng)并非為蛋白質(zhì)所特有。 【實(shí)驗(yàn)試劑和器材】 1．試劑 ⑴ 10% NaOH溶液。 ⑵ 雙縮脲試劑：稱取硫酸銅（cupric sulfate，CuSO4•5H2O，A.R.或C.P.)1.50 g，酒石酸鉀鈉（potassium sodium tartrate，NaKC4H4O6•4H2O，A.R.或C.P.)6.0 g，分別用蒸餾水約250 mL溶解后，全部轉(zhuǎn)移于1 L容量瓶中，混合；再加入10% NaOH溶液300 mL，隨加隨搖勻；最后用蒸餾水稀釋至1 L，保存于塑料試劑瓶中。如無紅色或黑色沉淀出現(xiàn)，此試劑可長(zhǎng)期使用。 ⑶ 標(biāo)準(zhǔn)血清：收集足量的新鮮血清（單份的或混合的)，每100 mL加入疊氮鈉50 mg，置于冰箱內(nèi)分裝后冰凍保存。 ⑷ 生理鹽水，即0.9%的NaCl溶液。 2．器材 ⑴ 試管及試管架。 ⑵ 刻度吸量管。 ⑶ 722型分光光度計(jì)。 【實(shí)驗(yàn)步驟】 將血清標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)血清用生理鹽水作1/20稀釋（例如血清0.20 mL加生理鹽水3.80 mL)，然后按下表操作：
充分混和，室溫放置30分鐘。以空白管調(diào)零，在波長(zhǎng)540nm處讀取各管光密度值。 標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白濃度 = 65g/L (即每1000mL血清含65g蛋白質(zhì))。 計(jì)算：
【實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】 1．本法完全適用于血清（漿)總蛋白的測(cè)定。 2．本法顯色很穩(wěn)定，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行的測(cè)定中，標(biāo)準(zhǔn)管的光密度基本一致。 3．本顯色反應(yīng)剛開始后數(shù)分鐘，顏色逐漸加深，溫度較高時(shí)增色較快，但到30分鐘時(shí)，各種溫度下（20~40℃)顯色均已達(dá)到頂點(diǎn)，因此顯色時(shí)溫度無須恒定。 4．體液中除蛋白質(zhì)外，不能含有與雙縮脲試劑顯色的物質(zhì)。 （二) BCA法 【實(shí)驗(yàn)原理】 BCA(bicinchonininc acid)與二價(jià)銅離子的硫酸銅等其它試劑組成的試劑，混合一起即成為蘋果綠，即BCA工作試劑。在堿性條件下，BCA與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+，一個(gè)Cu+螯合二個(gè)BCA分子，工作試劑由原來的蘋果綠形成紫色復(fù)合物，最大光吸收強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度成正比。 【實(shí)驗(yàn)試劑和器材】 1. 試劑 ⑴ 試劑A：1％BCA二鈉鹽；2％無水碳酸鈉；0.16%酒石酸鈉；0.4％氫氧化鈉；0.95％碳酸氫鈉�；旌险{(diào)pH值至11.25。 ⑵ 試劑B：4％硫酸銅。 ⑶ BCA工作液：試劑A 100 mL＋ 試劑B 2 mL混合。 ⑷ 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液：用結(jié)晶牛血清白蛋白根據(jù)其純度用生理鹽水配制成1.5 mg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（純度可經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量而確定)。 ⑸ 待測(cè)樣品：用雙縮脲測(cè)定法的樣品稀釋而成。 2. 器材 ⑴ 722型分光光度計(jì)。 ⑵ 恒溫水浴箱。 ⑶ 中試管7支。 ⑷ 移液器。 【實(shí)驗(yàn)步驟】 1. 操作 取試管七支、編號(hào)，按下表操作：
混勻，37℃保溫30min，用562nm比色，測(cè)定光密度值。 2. 計(jì)算 ⑴ 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 ⑵ 以測(cè)定管光密度值，查找標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待測(cè)血清中蛋白質(zhì)濃度(g/L)。 ⑶ 再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)管中選擇一管與測(cè)定管光密度相接近者，求出待測(cè)血清中蛋白質(zhì)濃度(g/L)。 【實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】 1. 該測(cè)定方法操作簡(jiǎn)單，快速，45分鐘內(nèi)完成測(cè)定。 2. 準(zhǔn)確靈敏，試劑穩(wěn)定性好，BCA試劑的蛋白質(zhì)測(cè)定范圍是20~200μg/mL，微量BCA測(cè)定范圍在0.5~10 μg/mL。 3. 經(jīng)濟(jì)實(shí)用，除試管外，測(cè)定可在微板孔中就進(jìn)行，大大節(jié)約樣品和試劑用量。 4. 抗試劑干擾能力比較強(qiáng)，如去垢劑，尿素等均無影響。 5. 此法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，近些年被科研工作者廣泛選用。目前BCA法的試劑盒市面有售。 （三)考馬斯亮藍(lán)G-250法 【實(shí)驗(yàn)原理】 考馬斯亮藍(lán)（Coomassie brilliant blue)G-250存在兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色，能與蛋白質(zhì)通過范德華氏引力而結(jié)合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合成正比，故可用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，最大光吸收由465nm變成595nm，通過測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。 蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合反應(yīng)很快，約2分鐘即可完成達(dá)最大光吸收，并可穩(wěn)定約1小時(shí)，之后發(fā)生聚合并沉淀。此法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的靈敏度很高，比Lowry法靈敏4倍，測(cè)定范圍在10~250μg蛋白質(zhì)。顯色反應(yīng)重復(fù)性好，精確度高，線性關(guān)系好，干擾物少，但大量去污劑存在時(shí)對(duì)顯色反應(yīng)影響太大且不易消除。 【實(shí)驗(yàn)試劑和器材】 1．試劑 ⑴ 考馬斯亮藍(lán)試劑：稱取考馬斯亮藍(lán)（Coomassie brilliant blue)G-250 100 mg溶于95%乙醇50 mL中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000 mL，濾紙過濾。最終試劑中含0.01%（W/V)考馬斯亮藍(lán)G-250，4.75%（V/V)乙醇，8.5%（V/V)磷酸。 ⑵ 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：準(zhǔn)確稱取一定量經(jīng)干燥恒重的結(jié)晶牛血清白蛋白，用生理鹽水配制成0.1 mg/mL蛋白溶液。 ⑶ 0.9% NaCl（生理鹽水)。 2．器材 ⑴ 試管及試管架。 ⑵ 刻度吸量管。 ⑶ 722型分光光度計(jì)。 【實(shí)驗(yàn)步驟】 測(cè)定血清樣品蛋白質(zhì)的含量時(shí)，先取血清0.1mL置于50mL容量瓶中，再加0.9%NaCl至刻度，混勻，此為稀釋500倍待測(cè)標(biāo)本。 取試管3支，按下表操作：
混勻各管，5分鐘后，以空白管調(diào)零，在波長(zhǎng)595nm處測(cè)定各管光密度值。 計(jì)算：
【實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】 1．微量測(cè)定時(shí)，可將取樣量和試劑量減至20%量進(jìn)行測(cè)定。 2．如果測(cè)定要求嚴(yán)格，可在顯色后5~20min內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，此段時(shí)間顏色最穩(wěn)定。 3．測(cè)定中，會(huì)有少量蛋白-染料復(fù)合物吸附于比色杯壁上，此吸附量可以忽略，測(cè)定完畢后可用乙醇將比色杯清洗干凈。 4. 強(qiáng)堿緩沖劑在測(cè)定中有一些顏色干擾，可以用適當(dāng)?shù)木彌_液對(duì)照扣除其影響。 （四)紫外分光光度法 【實(shí)驗(yàn)原理】 蛋白質(zhì)分子組成中常含有色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，故可用280nm波長(zhǎng)的光密度大小來測(cè)定一般蛋白質(zhì)的含量。測(cè)定范圍為20~100μg/mL。 由于核酸在280nm波長(zhǎng)處也有光吸收，對(duì)蛋白質(zhì)的測(cè)定有干擾作用，但核酸的最大吸收峰在260nm處，如同時(shí)測(cè)定260衛(wèi)生資格考試網(wǎng)nm的光吸收，通過計(jì)算可以消除其對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定的影響。因此，溶液中存在核酸時(shí)必須同時(shí)測(cè)定280nm及260nm的光密度，方可通過計(jì)算測(cè)得溶液中的蛋白質(zhì)含量。此外，乙酸、琥珀酸、鄰苯二甲酸以及巴比妥等緩沖液在215nm波長(zhǎng)處有較大的光吸收，不能應(yīng)用。 此法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、迅速，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定，因而在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用。此法的缺點(diǎn)是當(dāng)樣品蛋白質(zhì)中色氨酸和酪氨酸殘基的組成與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的組成相差較大時(shí)，測(cè)定結(jié)果有一定的誤差；當(dāng)樣品中存在核酸等紫外吸收物質(zhì)時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。 【實(shí)驗(yàn)試劑和器材】 1．試劑 ⑴ 生理鹽水。 ⑵ 血清。 2．器材 ⑴ 試管和吸量管。 ⑵ 容量瓶（50mL)。 ⑶ 752型紫外-可見分光光度計(jì)。 【實(shí)驗(yàn)步驟】 1．稀釋血清（或其他蛋白質(zhì)溶液)：準(zhǔn)確吸取0.1mL血清置于50mL容量瓶中，用生理鹽水稀釋至刻度（即稀釋500倍)。 2．測(cè)定光密度：在紫外分光光度計(jì)上，將稀釋的蛋白質(zhì)溶液小心盛于石英比色杯中，以生理鹽水為對(duì)照，測(cè)得280nm及260nm兩種波長(zhǎng)的光密度值。 計(jì)算： 將280nm及260nm波長(zhǎng)處測(cè)得的光密度值按下列校正經(jīng)驗(yàn)式計(jì)算蛋白質(zhì)濃度： 蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)= (1.45A280— 0.74A260)×500 【實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】 1．不同的蛋白質(zhì)及核酸的光吸收率不是恒定不變的，所以可能產(chǎn)生誤差。另一方面像嘌呤堿、嘧啶堿一類物質(zhì)在波長(zhǎng)260nm和280nm處也有光吸收。因此，樣品中核酸含量必須在20%以下，A280/A260＞1.5時(shí)方可用上述公式計(jì)算蛋白質(zhì)含量。 2．本法對(duì)微量蛋白的測(cè)定既快又方便，它還適用于硫酸銨或其他鹽類混雜的情況，這時(shí)用其他方法測(cè)定則往往比較困難。 3．如為純蛋白質(zhì)樣品，可根據(jù)蛋白質(zhì)在280nm附近的標(biāo)準(zhǔn)吸光系數(shù)，直接測(cè)定該蛋白質(zhì)的含量。如牛血清蛋白的
（式中A280為280nm波長(zhǎng)處測(cè)得的光密度值)。 4．為簡(jiǎn)便起見，對(duì)于混合蛋白質(zhì)溶液，可用A280乘以0.75來代表其中蛋白質(zhì)的大致含量（mg/mL)。 【思考題】 1. 以上幾種測(cè)定蛋白質(zhì)的方法有何區(qū)別與意義？ 2. 除以上方法外，其他還有什么方法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量? 3. 各種測(cè)定蛋白質(zhì)方法的原理是什么? 4. 紫外與可見光分光光度法有哪些相同點(diǎn)和不同點(diǎn)?
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為6.3，則待測(cè)樣品中牛血清蛋白含量可用下式計(jì)算：