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2.1 成骨細胞的分離。培養(yǎng)和初步鑒定
成骨細胞接種后24 h后即可見大量貼壁細胞,細胞呈長梭型,多角形或不規(guī)則型,48 h后可見細胞融合70% ~ 80%。
2.2 成骨細胞的總RNA提取
總RNA后電泳結(jié)果顯示:可見18S和28S兩條條帶,亮度28S:18S ≈ 2:1,初步表示所提RNA完整。分光度測定結(jié)果:D(260) = O.473,D(280)= 0.233,D(260)/D(280) = 2.03,表示所提RNA純度符合要求(圖1A)。
2.3 RT-PCR獲取與擴增LMP-1基因
取目的與內(nèi)參PCR產(chǎn)物各5 。滋L進行電泳(圖1B)。
2.4 入門克隆的酶切鑒定
入門克隆的酶切鑒定結(jié)果見圖2。
2.5 病毒質(zhì)粒載體與測序結(jié)果
病毒表達質(zhì)粒送于上海英俊生物公司測序,并與Genebank中LMP-1(基因號:AF095585)做BLAST比較,發(fā)現(xiàn)系列一致,沒有突變。
2.6 病毒載體在293A細胞中的包裝
按照前述條件轉(zhuǎn)染,8 d后293A細胞出現(xiàn)約100%CPE(細胞病毒效應(yīng)),細胞感染病毒后,用病毒上清提取病毒DNA為模板,以前述目的基因引物為引物作PCR檢測,電泳可檢測出目的條帶,説明病毒液中含有目的基因(圖3)。
2.7 全骨髓細胞培養(yǎng)
3 d后可見少量長梭形貼壁細胞,半量換液,1周后可見MSC貼壁集落形成,細胞疏密不均,9 d后予以傳代,第2代MSC呈長梭形。紡錘形生長,形態(tài)仍不均1,3代MSC呈長梭形,漩渦狀生長,形態(tài)較為均一。將第3代MSC進行成骨成脂誘導(dǎo)4周后進行茜素紅以及油紅O染色,分別可見礦化結(jié)節(jié)以及脂滴陽性顯色。將第3代MSC進行流式細胞儀檢測,可見CD29+ 約96.27%;CD44+ 約99.51%;CD105+ 約90.38%;CD45- 約96.08%。
2.8 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)液中堿性磷酸酶測定
分別收集轉(zhuǎn)染1周后,2周后各組各孔的培養(yǎng)液,利用ELISA方法測定ALP含量,發(fā)現(xiàn)個轉(zhuǎn)染組在1周末,2周末的ALP,含量均高于對照組,經(jīng)過方差分析統(tǒng)計比較,F值分別為:106.19和9.92,均P < 0.01,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;SNK兩兩比較,發(fā)現(xiàn)除E組,F組差異比較沒有統(tǒng)計學(xué)意義,其余各組相互比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義,即表明當(dāng)轉(zhuǎn)染MOI = 10具有最強的誘導(dǎo)堿性磷酸酶活性作用。
2.9 轉(zhuǎn)染后骨鈣素的測定
收集各組各孔1周后,2周后的培養(yǎng)液,利用ELISA法測定骨鈣素含量,發(fā)現(xiàn)各組比較情況與ALP類似,方差分析結(jié)果,F值分別為:114.88和193.15,均P < 0.001,各組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;兩兩比較,E組,F組,以及兩周末的B組與D組差異比較沒有統(tǒng)計學(xué)意義,其余各組相互比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義,表明轉(zhuǎn)染MOI = 10時具有最強的誘導(dǎo)骨鈣素表達作用,與上述堿性磷酸酶一致(表1,2)。
2.10 免疫組化
顯示轉(zhuǎn)染2周后組骨鈣素,Ⅰ型膠原的表達明顯高于對照組,3周后茜素紅染色顯示礦化結(jié)節(jié)染色明顯,結(jié)果顯示見圖5 A-D。
2.11 Western-blot檢測
LMP-1基因在MSC中的表達,可見轉(zhuǎn)染組表達的濃度顯著高于對照組(圖6)。
3 討 論
由于骨質(zhì)疏松(osteoporosis, OP)患者成骨能力低下,骨折手術(shù)失敗率高,愈合緩慢甚至不愈合[2],OP骨折的治療多年以來一直是困繞骨科臨床醫(yī)生的難題之一�；蛑委煿琴|(zhì)疏松骨折目前仍是一個有待開墾的嶄新領(lǐng)域。MSC的生物學(xué)特性表明它能作為基因治療理想的靶細胞和載體,LMP-1作為細胞內(nèi)的蛋白不僅能高效地誘導(dǎo)骨的形成,更能刺激多種骨誘導(dǎo)因子(包括BMPs。TGF-β1等)的分泌,為骨折的修復(fù)提供非常有利的環(huán)境。因此選擇LMP-1作為載體,以MSC作為基因治療的靶細胞,LMP-1 cDNA轉(zhuǎn)染MSC,促進MSC增殖和成骨細胞分化,提高MSC的成骨活性,用含LMP-1cDNA的MSC治療OP骨折。是對基因治療OP骨折這種新方法和途徑的探索。
骨誘導(dǎo)因子大多是細胞外分泌型因子,是由細胞外蛋白或是由傳遞細胞間信號的多肽構(gòu)成,如BMP等。與BMP不同, LMP-1是細胞內(nèi)因子,作為細胞內(nèi)信號分子,它能于體內(nèi)。體外啟動骨的形成。LMP-1不是分泌型因子,它是能刺激其它骨誘導(dǎo)因子合成和分泌的細胞內(nèi)蛋白。表達LMP-1的細胞能合成和分泌多種不同骨誘導(dǎo)因子(包括BMP。TGF-β1等),同時招募臨近的細胞分化并直接參加骨膜或軟骨內(nèi)成骨[1],這樣也就為成骨能力低下的疏松骨組織提供了非常有利于骨形成的環(huán)境。動物以及體外實驗表明,使用非常小劑量的腺病毒或質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染LMP-1 cDNA的骨髓細胞,能持續(xù)高效地誘導(dǎo)骨形成,促進脊柱的融合。CT掃描還顯示表達LMP-1細胞的存在增加了融合塊的密度并使載體邊界有更多的骨形成[3-5]。國內(nèi)外關(guān)于骨誘導(dǎo)因子促進骨形成的大多數(shù)研究都集中在BMP上,關(guān)于LMP-1的研究相對較少[6]。研究的對象主要為骨缺損的修復(fù)以及脊柱的后路融合,途徑為轉(zhuǎn)基因技術(shù)和重組蛋白應(yīng)用。研究結(jié)果表明,兩種方法均能促進骨的形成,但基因治療較重組蛋白必要時能提供更持續(xù)的蛋白釋放,而且能以更符合生理要求的方式提供蛋白[7]。重組蛋白誘導(dǎo)的新骨不規(guī)則地填充于骨折端的邊緣,骨小梁比較脆弱,象殼一樣圍繞骨缺損處;轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的新骨為堅實的三維骨小梁結(jié)構(gòu),并重建形成新的骨皮質(zhì)[8]。與BMP不同,LMP-1為細胞內(nèi)信號分子直接刺激成骨細胞的分化,并刺激其它骨誘導(dǎo)因子合成和分泌,因此治療性應(yīng)用LMP-1,其基因cDNA的轉(zhuǎn)染是必須的。也是最好的途徑[4]。LMP-1在體內(nèi)外高效的成骨作用是我們選擇其作為治療骨質(zhì)疏松及其骨折候選基因的主要原因。
腺病毒是目前轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炑芯?a class="channel_keylink" href="http://m.52667788.cn/mingzu/2009/20090512123016_154714.shtml" target="_blank">中使用最多的病毒載體。目前大多采用Adeasy系統(tǒng)來構(gòu)建和包裝腺病毒載體。本試驗采用了Invitrogen公司的GatewayTM技術(shù)進行病毒載體構(gòu)建,首先將目的基因進行TOPO定向克隆至入門載體,然后利用入門載體克隆與病毒骨架在體外進行同源重組,將目的基因轉(zhuǎn)入病毒骨架,轉(zhuǎn)化篩選,整個過程只需兩步。這項技術(shù)的特點是只需設(shè)計引物時在目的基因前加上CACC接頭,PCR產(chǎn)物即可利用接頭與入門載體pENTR/D-TOPO進行TOPO定向克隆,5 min即形成入門克隆,再轉(zhuǎn)化細菌篩選陽性克隆,由于入門載體自身是線性,只有在TOPO克隆成功才能與目的基因連接成環(huán)狀,完成滾環(huán)復(fù)制,因此所得陽性克隆特異性高。入門克隆獲取后可利用同源位點和表達載體pAD/CMV/V5-DESTTM在體外進行同源重組反應(yīng),只需6 ~ 8 h并可轉(zhuǎn)化細菌篩選重組子,同時由于表達載體含有自我死亡基因ccdB,重組后被目的基因替代,沒有重組成功的表達載體自然死亡,重組子的特異性也相對特異較高。除了用來鑒定外,構(gòu)建過程中不需要酶切反應(yīng),不需要藍白菌落篩選,整個構(gòu)建過程操作相對簡單。快捷。本實驗結(jié)果表明,利用GatewayTM技術(shù)構(gòu)建LMP-1重組腺病毒載體不僅大大簡化了基因克隆的步驟,而且顯著提高了克隆效率。獲得的pAd-LMP-1可進一步用于基因治療理想的靶細胞的轉(zhuǎn)染,構(gòu)建骨質(zhì)疏松癥及其骨折的基因治療的細胞載體。
