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1 材料與方法
1.1 主要試劑
新生牛血清購于杭州四季青生物;低糖DMEM培養(yǎng)基購于Gibco公司;Ⅰ型膠原酶。Ⅱ型膠原酶購于Sigma公司;Trizol。DEPC 。RT-PCR試劑盒。Pfu高保真聚合酶。瓊脂糖。DNA回收試劑盒。DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker。質(zhì)粒小提試劑盒。病毒DNA提取試劑盒均購于Takara(大連)公司;入門載體試劑盒(含TOP10感受態(tài)菌)。表達(dá)載體pAD/CMV/V5-DEST(含293A細(xì)胞)。LR ClonaseTM 酶購于Invitrogen公司;內(nèi)切酶NotⅠ。AscⅠ。PacⅠ均購于NEB公司。MSC誘導(dǎo)藥物地塞米松。胰島素。β磷酸甘油。IBMX。維生素C。吲哚美辛購于Sigma公司,染色試劑油紅O。茜素紅購于AMRESCO公司,免疫組化用一抗兔抗大鼠Ⅰ型膠原,兔抗大鼠骨鈣素。二抗羊抗兔IgG及 SABC試劑盒均購于武漢博士德公司;兔抗大鼠LMP-1抗體購于美國Santa Cruze公司;堿性磷酸酶Elisa檢測試劑盒。骨鈣素Elisa檢測試劑盒均購于武漢華美生物公司。
1.2 大鼠LMP-1基因的獲取
1.2.1 大鼠成骨細(xì)胞的分離與體外培養(yǎng)以及鑒定
取SD乳鼠兩只放入750 mL/L酒精中浸泡10 min。無菌取顱蓋骨,置于含PBS液的培養(yǎng)皿中,盡量剔除附著的血管及結(jié)締組織,PBS液清洗,再將顱蓋骨剪成1 mm × 1 mm碎塊,轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中,1 g/L膠原酶(Ⅰ型:Ⅱ型 = 1:6)消化液37 ℃水浴消化20 min,并每隔2 min搖晃震蕩一次,共消化4次,分別取后兩次消化液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管予以250 × g離心10 min,棄去上清液,沉淀即為成骨細(xì)胞,用含100 mL/L新生牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液重懸,吹打均勻至單個懸細(xì)胞,按1 × 105/mL密度接種到25 cm2培養(yǎng)瓶中,37 ℃。50 mL/L CO2。飽和濕度下培養(yǎng),傳代。
1.2.2 大鼠成骨細(xì)胞總RNA的提取 取2代大鼠成骨細(xì)胞將培養(yǎng)液換成含1 nmol/L地塞米松和100 mL/L胎牛血清培養(yǎng)液(L-DMEM)誘導(dǎo)培養(yǎng)一周[1],當(dāng)細(xì)胞融合近90%后,吸棄培養(yǎng)液,PBS沖洗兩次,按照Trizol説明書進(jìn)行細(xì)胞RNA提取,每只25 cm2 中加入Trizol液1 mL,最終所得的RNA利用30 μL的DEPC水溶解,并對其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和分光光度檢測,其余的RNA置于 -80 ℃冰箱保存。按D(260) = 1的RNA溶液每mL約含40 μg RNA來估算所得到RNA的濃度,根據(jù)在260 nm以及在280 nm的讀數(shù)間的比值D(260)/D(280)估計核酸的純度。
1.2.3 RT-PCR獲取與擴(kuò)增LMP-1基因 RT-PCR利用TAKARA RT-PCR試劑盒進(jìn)行兩步法反應(yīng):第一步反應(yīng)體系選用Oligo引物,按照試劑盒説明書依次加入反應(yīng)體系于100 μL PCR管中,置于PCR儀中45 ℃,25 min,然后95 ℃,10 s使逆轉(zhuǎn)錄酶變性,得到的cDNA用于PCR,剩余可保存于 -20 ℃。第二鏈合成中引物根據(jù)Genebank中大鼠LMP-1基因利用Primer 5軟件設(shè)計而成:正義引物:5′-CACC ATGGATTCCTTCAAGGTAGTGC-3′,反義引物:5′-GGGCTTGTCCTTCTTGGAGTAG-3′,其中CACC是目的基因與入門載體之間的接頭,并且框中結(jié)構(gòu)形成Kozak序列,有助于增強(qiáng)目的基因的表達(dá)[2],預(yù)計合成1 341 bp的產(chǎn)物。大鼠GAPDH內(nèi)參引物:正義:5′-CAGTGCCAGCCTCG TCTCAT-3′,反義:5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′,預(yù)計合成571 bp的產(chǎn)物。聚合酶采用TAKARA高保真酶,采用50 μL反應(yīng)體系進(jìn)行30個循環(huán)反應(yīng)(98 ℃,10 s;56 ℃,10 s;72 ℃,1 min 25 s),最后延伸7 min后收集產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定,并利用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收,測D值進(jìn)行濃度分析。
1.3 LMP-1重組腺病毒載體的構(gòu)建
1.3.1 LMP-1與入門載體pTREN-TOPO構(gòu)建入門克隆 根據(jù)純化目的基因的濃度進(jìn)行6 μL的TOPO反應(yīng)體系:PCR純化產(chǎn)物0.5 μL。鹽溶液1 μL。入門載體1 μL。無菌水3.5 μL,輕輕混勻,室溫(約25 ℃)靜置5 min后冰浴10 min,取2 μL TOPO反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)大腸桿菌,最后涂在含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板進(jìn)行篩選,平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱16 ~ 24 h后觀察陽性克隆。無菌操作下挑取單個陽性克隆置于含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基4 mL置于37 ℃,水平轉(zhuǎn)速為250 r/min的恒溫?fù)u床搖菌8 h,按照質(zhì)粒提取試劑盒説明操作進(jìn)行質(zhì)粒提取,并對提取的質(zhì)粒分別進(jìn)行NotⅠ。AscⅠ單酶切和雙酶切鑒定。
