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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論文:SphK1突變抑制高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞纖維連接蛋白過度表達的研究
[提要] 目的 研究鞘氨醇激酶-1（SphK1)突變是否抑制了高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中纖維連接蛋白（FN)的過度表達。 方法 采用Western blot檢測FN的表達。 結(jié)果 系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染了SphK1突變質(zhì)粒后可消除高糖誘導(dǎo)的FN上調(diào)效應(yīng)。 結(jié)論 本研究結(jié)果證明了SphK1在高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞FN表達過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。
[關(guān)鍵詞] SphK1；纖維連接蛋白；系膜細(xì)胞
[中圖分類號] R587.2；R692.9 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013)15-0010-02
系膜細(xì)胞（Mesangial cell，MC)是腎小球的主要功能細(xì)胞，無論在腎臟的生理功能還是病理變化中均發(fā)揮著重要的作用；現(xiàn)已認(rèn)為MC主要參與了糖尿病腎病腎小球硬化損傷過 程。FN是由系膜細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分之一，在糖尿病狀態(tài)下，腎小球系膜細(xì)胞FN等細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，導(dǎo)致腎小球硬化、促進糖尿病腎病的病變進 程[1]。鞘氨醇激酶（sphingosine kinase， SphK)是催化S1P生成的關(guān)鍵限速酶[2]。我們前期研究表明：用四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型12周后，模型組小鼠在腎小球結(jié)構(gòu)異常、腎功能降低的基 礎(chǔ)上，SphK1蛋白表達與活性較正常組相比明顯升高；免疫組化結(jié)果顯示，小鼠腎組織的SphK1主要表達于腎小球細(xì)胞，而模型組與正常組相比顯著升高 [3]，提示在糖尿病狀態(tài)下SphK1的激活可能參與了糖尿病腎病的病變進程。本研究重點觀察SphK1對細(xì)胞外基質(zhì)主要成分-FN的調(diào)節(jié)作用，探討糖尿 病狀態(tài)下高糖激活的SphK1對系膜細(xì)胞FN生成的具體分子機制。
1 材料與方法 醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站m.52667788.cn
1.1 腎小球系膜細(xì)胞原代培養(yǎng)
采用逐級過篩法從SD大鼠的腎臟分離得到腎小球，用完全培養(yǎng)基（DMEM+20%胎牛血清+胰島素 0.66 U/mL+ 2 mM谷氨酰胺+青霉素100 U/mL+鏈霉素100 μg/mL)約2滴，用吸管重懸腎小球，加入塑料培養(yǎng)瓶中，向各方向輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，使含腎小球的細(xì)胞懸液均勻分布于瓶底，待細(xì)胞懸液近干時，然后迅速倒 轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶（使培養(yǎng)面朝上)，加入約5 mL完全培養(yǎng)液，放入CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，4 h后，再輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來。待原代腎小球系膜細(xì)胞長滿瓶底后，吸棄培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基，用PBS沖洗培養(yǎng)瓶。加入0.25%胰蛋白酶消化約1～3 min，鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞突起回縮，細(xì)胞間隙增大，或輕輕振動后絕大部分細(xì)胞懸浮、漂移，立即加入含血清培養(yǎng)基終止消化，于1000 rpm離心5 min，傳代培養(yǎng)基懸浮GMC至所需濃度，按1∶2比例傳代培養(yǎng)。實驗采用第3代到第15代之間的細(xì)胞。
1.2 質(zhì)粒和瞬時轉(zhuǎn)染
空載體（Vector)，突變型質(zhì)粒（SphKG82D)由澳大利亞Dr. Pu Xia贈送。按照產(chǎn)品說明書采用Lipofectamine 2000（Invitrogen)轉(zhuǎn)染系膜細(xì)胞72 h后收集細(xì)胞。
