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1.3 Western blot
細(xì)胞經(jīng)裂解提取蛋白后，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)膜至PVDF。采用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，將一抗、二抗孵育后，采用增強(qiáng)型的化學(xué)發(fā)光液檢測(cè)條帶信號(hào)。膜重孵鼠單抗 α-tubulin作為內(nèi)參對(duì)照。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
數(shù)值采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析結(jié)合Bonferroni校正分析多組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
SphK1突變抑制了高糖誘導(dǎo)MC的FN表達(dá)，MC分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒Vector和突變型質(zhì)粒SphKG82D。結(jié)果表明，高糖能明顯上調(diào)FN 的表達(dá)；轉(zhuǎn)染了SphKG82D質(zhì)粒后顯著抑制了高糖誘導(dǎo)的FN表達(dá)，而轉(zhuǎn)染Vector質(zhì)粒無(wú)此效應(yīng)，證明SphK1參與了高糖誘導(dǎo)的FN表達(dá)。
3 討論醫(yī).學(xué)全.在.線(xiàn)網(wǎng)站m.52667788.cn
系膜細(xì)胞是腎臟的主要功能細(xì)胞，糖尿病狀態(tài)下，腎小球系膜細(xì)胞FN等細(xì)胞外基質(zhì)成分的積聚是導(dǎo)致腎小球硬化、促進(jìn)糖尿病腎病病變形成的重要特 征。因此，我們采用體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討高糖環(huán)境下腎小球系膜細(xì)胞S1P信號(hào)通路的激活與細(xì)胞外基質(zhì)成分FN生成的關(guān)聯(lián)性，以明確高糖激活的S1P信號(hào)通路 參與糖尿病腎病病理進(jìn)程的作用機(jī)制。
SphK1是催化S1P生成的關(guān)鍵酶[2，4，5]。研究表明：長(zhǎng)期高血糖、AGEs、氧化應(yīng)激等可激活SphK1，進(jìn)而導(dǎo)致S1P的生成增 加[6-9]。以往研究表明S1P在腎小球系膜疾病中起著重要作用[10-12]。外源性S1P可顯著促進(jìn)GMC增殖[10-12]，導(dǎo)致腎臟疾病的發(fā) 生。
近年來(lái)，SphK1-S1P信號(hào)通路與包括糖尿病腎病在內(nèi)的糖尿病性血管并發(fā)癥的關(guān)系日益受到關(guān)注，成為相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。慢性高血糖現(xiàn)被 認(rèn)為是糖尿病微血管及大血管病變的主要致病因素；血管內(nèi)皮損傷是導(dǎo)致糖尿病慢性血管病變的起始環(huán)節(jié)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，高血糖能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞SphK1 的活化，參與了內(nèi)皮損傷過(guò)程。同樣在高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中SphK活性也有顯著增加，采用siRNA技術(shù)證明高糖主要激活SphK16。高血糖狀態(tài)下形成 的AGEs現(xiàn)已證明是外周微血管病變的主要致病因素之一，導(dǎo)致糖尿病腎病和終末期腎衰竭。Geoffroy等用AGEs處理GMC，發(fā)現(xiàn)當(dāng)AGEs低濃度 時(shí)，神經(jīng)酰胺酶和鞘氨醇激酶活性明顯升高，導(dǎo)致S1P積聚，誘使GMC增殖。Geoffroy隨后觀(guān)察了STZ誘導(dǎo)小鼠4 d后腎臟中SphK1活性和S1P含量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著腎小球系膜細(xì)胞輕度增殖，腎臟中SphK1活性和S1P均顯著增加，提示SphK1-S1P信 號(hào)通路可能參與了糖尿病腎小球增殖過(guò)程[8，9]。
本研究發(fā)現(xiàn)：在正常糖培養(yǎng)情況下，MC經(jīng)過(guò)高糖培養(yǎng)后，F(xiàn)N的表達(dá)顯著升高，而轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒SphKG82D的MC，幾乎完全抵消高糖誘導(dǎo) 的MC中FN上調(diào)效應(yīng)，提示高糖誘導(dǎo)的FN過(guò)度表達(dá)需要SphK1的參與調(diào)節(jié)，為探尋將SphK1-S1P信號(hào)通路作為抗糖尿病腎病的可能作用靶點(diǎn)奠定基 礎(chǔ)�！ 參考文獻(xiàn)]
[1] Raptis AE， Viberti G. Pathogenesis of diabetic nephropathy[J]. Exp Clin Endocrinol Diabetes，2001，109 Suppl 2：S424-437.
