| 公開(公告)號 | CN1869217A |
| 公開(公告)日 | 2006.11.29 |
| 申請(專利)號 | CN200610081469.8 |
| 申請日期 | 2006.05.22 |
| 專利名稱 | 以腺病毒為載體乳腺表達生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因蛋白藥物的方法 |
| 主分類號 | C12N15/09(2006.01)I |
| 分類號 | C12N15/09(2006.01)I;C12N15/861(2006.01)I;C12P21/02(2006.01)I;A61K38/17(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 李青旺;秦皇島市科技投資公司;燕山大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 李青旺;韓增勝 |
| 地址 | 066004河北省秦皇島市海港區(qū)河北大街西段438 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | 秦皇島市維信專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 鄂長林 |
| 國省代碼 | 河北;13 |
| 主權(quán)項 | 一種以腺病毒為載體乳腺表達生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因蛋白藥物的方法，其特征在于：該方法包括以下步驟： (1)、分離、克隆目標藥物蛋白基因序列： 以pUC18、pUC19、pGEM-3ZF、pShuttle、pcDNA3系列質(zhì)粒為克隆載體，將目標蛋白或細胞因子hLTF(人乳鐵蛋白基因)、hGH(人生長激素基因)、hEPO(人促紅細胞生成素)、t-PA(組織型纖溶酶原激活劑)、IL-15(白細胞介素-15)、human Protein C(人蛋白C)、IL-2(白細胞介素-2)、hVEGF(血管內(nèi)皮細胞生長因子)、NKSF(自然殺傷細胞刺激因子)、HGF(肝細胞生長因子)10種蛋白藥物基因通過分子克隆，分別獲得了含有目標基因的質(zhì)粒系列載體； (2)、將所克隆目標蛋白基因與單標記篩選載體或雙標記選擇載體構(gòu)成融合真核表達載體，體外真核細胞表達檢測目標蛋白，獲得體外表達正確的藥物蛋白基因： 以COS7(非洲綠猴腎細胞)、CHO(中國倉鼠卵巢細胞)、HEK293(人胚胎腎細胞)為宿主細胞對所構(gòu)建的真核融合蛋白表達載體進行體外表達；Western Blotting、ELASA檢測目標基因表達水平，獲得了體外表達正確的所需蛋白藥物基因； (3)、將所需目標蛋白基因與腺病毒基因組骨架分子重組，獲得含重組目標藥物蛋白基因的腺病毒載體： 將所需目標基因接入穿梭載體，再與腺病毒基因組骨架質(zhì)粒在細菌或真核細胞中重組，并在腺病毒包裝細胞系生產(chǎn)出含有重組目標蛋白基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體； (4)、將該重組目標藥物蛋白基因腺病毒載體導(dǎo)入動物乳腺： 以重組目標蛋白基因的復(fù)制缺陷型腺病毒為載體，直接導(dǎo)入動物乳腺，使目標蛋白基因在乳腺上皮細胞內(nèi)表達，利用乳腺上皮細胞基本特性，將目標蛋白分泌到動物乳汁中； (5)、乳汁中分泌獲得所需目標藥物蛋白，獲得高表達目標蛋白藥物的動物。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開一種以腺病毒為載體乳腺表達生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因蛋白藥物的方法。其特征是：利用復(fù)制缺陷型腺病毒骨架質(zhì)粒載體攜帶不同種目標蛋白基因序列，在含有Ad5型腺病毒基因組E1A區(qū)序列的包裝細胞系獲得重組蛋白基因載體，在動物乳腺，獲得瞬時高效表達的各種外源目標基因藥物蛋白。操作步驟如下：(1)分離、克隆目標藥物蛋白基因序列；(2)將所克隆目標蛋白基因與單標記篩選載體或雙標記選擇載體構(gòu)成融合真核表達載體，體外真核細胞表達檢測目標蛋白，獲得體外表達正確的藥物蛋白基因；(3)將所需目標蛋白基因與腺病毒基因組骨架分子重組，獲得含重組目標藥物蛋白基因的腺病毒載體；(4)將該重組目標藥物蛋白基因腺病毒載體導(dǎo)入動物乳腺；(5)乳汁中分泌獲得所需目標藥物蛋白，獲得高表達目標蛋白藥物的動物。該乳汁中表達的重組蛋白可直接開發(fā)成各種保健品和藥品，含有重組目標蛋白的動物奶也可直接開發(fā)成高附加值的保健奶及奶制品。 |
| 國際公布 |
