| 公開(公告)號(hào) | CN1238522C |
| 公開(公告)日 | 2006.025 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN02155058.1 |
| 申請(qǐng)日期 | 2002.12.20 |
| 專利名稱 | 白細(xì)胞介素－2及其基因在戒毒應(yīng)用中的測(cè)試方法 |
| 主分類號(hào) | C12Q1/68(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C12Q1/68(2006.01)I;G01N33/68(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I;A61K38/20(2006.01)I;A61P25/36(2006.01)I |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 劉新恒;顧錦法;王晉慧;姚明忠 |
| 地址 | 200031上海市岳陽路319號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 上海新天專利代理有限公司 |
| 代理人 | 王 巍 |
| 國省代碼 | 上海;31 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 白細(xì)胞介素-2IL-2及其基因在戒毒應(yīng)用中的測(cè)試方法，其特征在于該方法包括下列步驟：(1)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-IL-2的構(gòu)建人IL-2基因經(jīng)EcoRI和XhoI酶切得到有EcoRI和XhoI接頭的全長(zhǎng)含信號(hào)肽的人IL-2cDNA462bp克隆入經(jīng)相同酶切的pcDNA3載體Invitrogen，IL-2基因在CMV啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109擴(kuò)增，堿裂解法制備質(zhì)粒，聚乙二醇沉淀法純化，通過測(cè)定260nm的光吸收來確定質(zhì)粒濃度，注射時(shí)質(zhì)粒稀釋于含5％葡萄糖的磷酸緩沖液中；(2)重組腺病毒Ad5-IL-2的構(gòu)建人IL-2基因經(jīng)EcoRI和XhoI酶切得到有EcoRI和XhoI接頭的全長(zhǎng)含信號(hào)肽的人IL-2cDNA462bp克隆入經(jīng)相同酶切的pCA13載體Microbix，得到pCA13-IL-2，此時(shí)IL-2基因在CMV啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，pCA13-IL-2與腺病毒基因組質(zhì)粒pBHG10Microbix共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，進(jìn)行同源重組，篩選重組腺病毒，擴(kuò)增純化腺病毒，注射時(shí)病毒稀釋于含5％蔗糖的PBS中；(3)嗎啡依賴小鼠模型的建立以劑量遞增法形成嗎啡依賴小鼠模型，此組小鼠為嗎啡依賴組，嗎啡依賴小鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1可激發(fā)戒斷癥狀，此組小鼠為嗎啡戒斷組；(4)嗎啡依賴大鼠模型的建立以劑量遞增法形成嗎啡依賴大鼠模型，此組大鼠為嗎啡依賴組，嗎啡依賴大鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1可激發(fā)戒斷癥狀，此組大鼠為嗎啡戒斷組；(5)IL-2蛋白及pcDNA3質(zhì)粒介導(dǎo)IL-2基因抑制小鼠嗎啡戒斷癥狀測(cè)試方法的建立用劑量遞增法建立的嗎啡成癮小鼠模型，在末次給嗎啡3小時(shí)后，將成癮的小鼠隨機(jī)分為8組，每組10只，蛋白治療組：經(jīng)第5與第6腰椎之間，蛛網(wǎng)膜下腔，分別注射5×103，1×104，2×104，4×104，8×104IUIL-2蛋白，對(duì)照組為含5％葡萄糖的0.01M磷酸緩沖液，IL-2基因治療組：8μgpcDNA3/8μglipofectamine，對(duì)照組，提前24小時(shí)注射，8μgpcDNA3-IL-2/8μglipofectamine，基因治療組，提前24小時(shí)注射，注射總體積為10μl，注射后5分鐘，各組小鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)戒斷癥狀，觀察小鼠開始跳躍的潛伏期、15分鐘內(nèi)小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)及30分鐘內(nèi)小鼠的體重變化；(6)IL-2蛋白抑制大鼠嗎啡戒斷癥狀測(cè)試方法的建立用劑量遞增法建立的嗎啡成癮大鼠模型，在末次給嗎啡3小時(shí)后，將成癮的大鼠隨機(jī)分為4組，每組5-11只，經(jīng)第5與第6腰椎之間插入導(dǎo)管鞘內(nèi)，蛛網(wǎng)膜下腔，分別注射2×104，4×104，1.4×105IUIL-2蛋白，對(duì)照組為含5％葡萄糖的PB，注射總體積為30μl，注射后5分鐘，各組大鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)戒斷癥狀，觀察大鼠的各種戒斷癥狀，如濕狗樣抖動(dòng)、異常姿勢(shì)、激惹、咬牙、腹瀉、流涎、體重減少，并計(jì)算戒斷癥狀總評(píng)分值；(7)腺病毒載體介導(dǎo)IL-2基因抑制小鼠嗎啡戒斷癥狀測(cè)試方法的建立大鼠經(jīng)第5與第6腰椎之間插入導(dǎo)管鞘內(nèi)，蛛網(wǎng)膜下腔，分別注射含5％蔗糖的PBS，1×107pfu腺病毒5型Ad5，1×107pfuAd5-IL-2，注射總體積為10μl，注射后一周測(cè)定腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)的戒斷癥狀，觀察小鼠開始跳躍的潛伏期、15分鐘內(nèi)小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)及30分鐘內(nèi)小鼠的體重變化；(8)成癮性試驗(yàn)a.小鼠豎尾試驗(yàn)：小鼠隨機(jī)分為六組，每組10只，分別腹腔注射嗎啡20mg.kg-1陽性對(duì)照，腹腔注射含5％葡萄糖的PB陰性對(duì)照，腹腔注射IL-2蛋白1×105IU或1×106IU，及蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白1×104IU或1×105IU，觀察給藥后2小時(shí)內(nèi)小鼠有無出現(xiàn)S形豎尾反應(yīng)；b.小鼠跳躍反應(yīng)試驗(yàn)：小鼠隨機(jī)分為三組，每組10只，分別皮下注射含5％葡萄糖的PB陰性對(duì)照組或嗎啡陽性對(duì)照組，腹腔注射IL-2蛋白，第一天注射5次，9:00、10:00、11:00、13:00、15:00，第二天注射2次9:00、11:00，嗎啡組小鼠起始劑量為2.5mg.kg-1，此后按5，10，20，30，40，50mg.kg-1劑量遞增；IL-2蛋白組劑量為1×104，2×104，4×104，8×104，1.6×105，3.2×105and6.4×105IU，于最后一次給藥后2小時(shí)，腹腔注射納洛酮10mg.kg-1，觀察10分鐘內(nèi)小鼠跳躍反應(yīng)次數(shù)；(9)統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析。 |
| 摘要 | 本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一種白細(xì)胞介素-2(IL-2)及其基因在戒毒應(yīng)用中的測(cè)試方法。通過本發(fā)明的方法表明蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白有較好的戒毒作用，其效果呈劑量依賴性。pcDNA3-IL-2基因也有一定的戒毒作用，通過對(duì)該基因?qū)霔l件的進(jìn)一步優(yōu)化，其戒毒效果可望更好，更適合實(shí)際實(shí)用。 |
| 國際公布 |
