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公開(公告)號
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CN1238512C
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公開(公告)日
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2006.01.25
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申請(專利)號
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CN200310112672.3
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申請日期
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2003.12.18
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專利名稱
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結(jié)締組織生長因子C區(qū)抗原的制備方法
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主分類號
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C12N15/63(2006.01)I
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分類號
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C12N15/63(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(專利權(quán))人
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東南大學(xué)
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發(fā)明(設(shè)計)人
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劉乃豐;吳國球
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地址
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210096江蘇省南京市四牌樓2號
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頒證日
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國際申請
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進(jìn)入國家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司
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代理人
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王之梓
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國省代碼
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江蘇;32
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主權(quán)項(xiàng)
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一種結(jié)締組織生長因子C區(qū)抗原的制備方法，其特征在于第一步：用NheI和XbaI酶對pCOMB3載體進(jìn)行雙酶切，切除兩酶切位點(diǎn)NheI和XbaI之間的272bp條帶后的載體用T4DNA連接酶自連后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，然后，以質(zhì)粒pET-28(a)+作模板，分別以p1：5’-GGCTCGAGGCCAACTCTAGTATGGCCC-3’及p2：5’-GGACTAGTCTAACCAGCACTTCAGTGGGAA-3’為上、下游引物，PCR擴(kuò)增后，可見550bp條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物，回收該條帶，并將回收的條帶與被切除272bp后的pCOMB3載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化JM109后篩選得到陽性質(zhì)粒pKM；第二步：用組織貼壁法進(jìn)行人內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)，用50mmol/L葡萄糖修飾的牛血清白蛋白對原代培養(yǎng)后的內(nèi)皮細(xì)胞干預(yù)8h，0.125％胰蛋白酶消化后，用Trizol法提取RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，在1.5ml管中依次加入：雙蒸H2O31.5μl，10×Taqbuffer5μl，10mol/LdNTP1μl，濃度為25pmol/μl的引物p3：5’CCCGGATCCGAAGCGGACCTAGAG-3’1μl，p4：5’-CCCAAGCTTTGCCATGTCTCCGTG-3’1μl，濃度為0.65μg/μl的cDNA模板10μl，濃度為5U/μl的TaqPlus聚合酶0.5μl，置于PCR儀擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94℃5min變性，94℃1min，65℃30sec，72℃1min，35個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保溫，再用SpeI和XhoI酶對PCR產(chǎn)物與陽性質(zhì)粒pKM分別進(jìn)行雙酶切后，用T4DNA連接酶使兩個片段通過粘性末端相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，從中獲得陽性質(zhì)粒pKMc1；第三步：將含陽性質(zhì)粒pKMc1的大腸桿菌JM109單菌落擴(kuò)增后，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷37℃誘導(dǎo)3h，得到含有結(jié)締組織生長因子C區(qū)242-349位氨基酸的大腸桿菌，超聲破碎細(xì)胞，用鎳離子樹脂親和層析獲得結(jié)締組織生長因子抗原。
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摘要
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結(jié)締組織生長因子抗原的制備方法，對pCOMB3載體雙酶切，切除272bp條帶后的載體用T4 DNA連接酶自連后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，以pET-28(a)+作模板擴(kuò)增，回收550bp條帶，將其與切除后的pCOMB3載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化后篩選得陽性質(zhì)粒；對人內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)，用牛血清白蛋白對其干預(yù)8h，胰蛋白酶消化，用Trizol法提取RNA，合成cDNA，在1.5ml管中加入：ddH2O 31.5μl，10×Taqbuffr5μl，10mol/L dNTP 1μl，25pmol/μl的引物，0.65μg/μl的cDNA模板10μ1，5U/μl的TaqPlus0.5μl，94℃5min變性，94℃1min，65℃30sec，72℃1min，35個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保溫下擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物與陽性質(zhì)粒雙酶切后，用T4DNA連接酶相連兩個片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，得pKMc1；將pKMc1的大腸桿菌單菌落擴(kuò)增，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷37℃誘導(dǎo)3 h，得大腸桿菌，超聲破碎，層析得結(jié)締組織生長因子抗原。
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國際公布
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