| 公開(公告)號 | CN1513999A |
| 公開(公告)日 | 2004.07.21 |
| 申請(專利)號 | CN03127082.4 |
| 申請日期 | 2003.06.18 |
| 專利名稱 | 一種新的蚓激酶基因突變體 |
| 主分類號 | C12N15/58 |
| 分類號 | C12N15/58;A61K38/49;A61K31/7088;A61P7/02 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 中國人民解放軍軍需大學(xué)軍事獸醫(yī)研究所 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 張守峰;扈榮良;涂長春 |
| 地址 | 130062吉林省長春市西安大路175號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 吉林長春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司 |
| 代理人 | 王薇 |
| 國省代碼 | 吉林;22 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種新的蚓激酶基因突變體，在保持編碼氨基酸序列不變的前提下，對經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得的蚓激酶cDNA序列中的真核細(xì)胞罕用密碼子進(jìn)行了突變改造，具體步驟如下：(1)在冰上將突變引物各10pmol、帶MgSO4的10×PCR緩沖液5μl、dNTPs 2nmol、含蚓激酶cDNA的質(zhì)粒pMD18-LK(3.6kb)100ng和pfu DNA聚合酶5U加入100μl PCR反應(yīng)管，加入去離子水補(bǔ)足至體積50μl，混勻后，在ABI-2700 PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，參數(shù)為：95℃預(yù)變性3min后進(jìn)入循環(huán)，95℃變性1min→55℃退火1min→68℃延伸7min，25個(gè)循環(huán)后，68℃延伸15min，降溫至4℃，結(jié)束PCR反應(yīng)；(2)在50μl PCR產(chǎn)物內(nèi)加入NEB Dpn I限制性內(nèi)切酶2μl(20U)，37℃水浴消化1h，取其中0.8μl，在冰上與30μl DH10B感受態(tài)大腸桿菌充分混勻，以1300V電壓電激轉(zhuǎn)化后，于1ml 37℃ LB培養(yǎng)基中低速振蕩培養(yǎng)1h，涂布氨芐青霉素抗性的LB瓊脂平板，過夜培養(yǎng)后，以無菌牙簽挑取單菌落，置10ml含適量氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基內(nèi)增菌，12-16h后小量提取質(zhì)粒供測序鑒定使用。 |
| 摘要 | 本發(fā)明涉及一種新的蚓激酶基因突變體，是以單步多位點(diǎn)突變多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reation，PCR)方法對經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得的蚓激酶cDNA(complementary DNA)進(jìn)行了突變，獲得了一個(gè)新的蚓激酶基因突變體。該突變體含有18個(gè)突變的堿基，但堿基突變后由其編碼的氨基酸序列不改變，突變的目的是使蚓激酶有利于在哺乳動(dòng)物組織和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。突變后的蚓激酶cDNA可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平表達(dá)出具有纖溶活性的蚓激酶。表達(dá)的蚓激酶纖維蛋白溶解活性高。 |
| 國際公布 |
