網(wǎng)站首頁
醫(yī)師
藥師
護士
衛(wèi)生資格
高級職稱
住院醫(yī)師
畜牧獸醫(yī)
醫(yī)學(xué)考研
醫(yī)學(xué)論文
醫(yī)學(xué)會議
考試寶典
網(wǎng)校
論壇
招聘
最新更新
網(wǎng)站地圖
您現(xiàn)在的位置: 醫(yī)學(xué)全在線 > 藥學(xué)理論 > 中國藥品專利文獻 > 正文:人PEX外泌型重組腺病毒的構(gòu)建方法和應(yīng)用專利檢索:專利號/專利人/發(fā)明人
    

人PEX外泌型重組腺病毒的構(gòu)建方法和應(yīng)用

公開(公告)號 CN101003794A  
公開(公告)日 2007.07.25  
申請(專利)號 CN200710008447.3  
申請日期 2007.01.11  
專利名稱 人PEX外泌型重組腺病毒的構(gòu)建方法和應(yīng)用  
主分類號 C12N7/01(2006.01)I  
分類號 C12N7/01(2006.01)I;C12N15/861(2006.01)I;C12N15/12(2006.01)I;C12N15/66(2006.01)I;A61K35/76(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I;A61P9/00(2006.01)I  
分案原申請?zhí)?  
優(yōu)先權(quán)  
申請(專利權(quán))人 廈門大學(xué)  
發(fā)明(設(shè)計)人 呂文清  
地址 361005福建省廈門市思明南路422號  
頒證日  
國際申請  
進入國家日期  
專利代理機構(gòu) 廈門南強之路專利事務(wù)所  
代理人 陳永秀;馬應(yīng)森  
國省代碼 福建;35  
主權(quán)項 人PEX外泌型重組腺病毒的構(gòu)建方法,其特征在于所說的構(gòu)建方法如下: 步驟1、質(zhì)粒pSecTag A/PEX的構(gòu)建 1)pGEX-4T-3/PEX215質(zhì)粒的構(gòu)建 (1)以從胎盤提取的組織總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成PEX cDNA第一條鏈; (2)根據(jù)人MMP2序列(Genbank Accession No.:NM_004530)和載體pGEX-4T-3的多克隆位點,設(shè)計二個PCR引物,上游引物PEX446S,序列為5’-CTG AAT TCC TCT CCT GACATT GAC CTT G-3’,帶限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切位點;下游引物PEX660A,序列為5’-CGC TCG AGA GGA AGG GCC TGT GG-3’,帶限制性內(nèi)切酶Xho I酶切位點; (3)以逆轉(zhuǎn)錄合成的第一條鏈為模板,利用PCR技術(shù),用上游引物PEX446S和下游引物PEX660A一起擴增人MMP2 cDNA 1629bp~2304bp片段,即長度為676bp的PEX cDNA片段,并重組入載體pGEX-4T-3中,得編碼人MMP2從446aa到660aa的PEX片段PEX215; (4)將PEX215重組于GST融合蛋白表達載體pGEX-4T-3,獲得序列正確的重組質(zhì)粒pGEX-4T-3/PEX215; 2)PCR技術(shù)擴增人MMP2 C端片段PEX cDNA 根據(jù)人MMP2序列(Genbank Accession No.:NM_004530)及其編碼框架以及pSecTag A載體多克隆位點,設(shè)計二條PCR反應(yīng)引物PEX466sense和PEX660antisense,其中上游引物PEX466sense,序列為5’-GTG TGG CCC AGC CGG CCC CTG AGA TCT GCA AAC-3’,帶限制性內(nèi)切酶Sfi I酶切位點;下游引物PEX660antisense,序列為5’-CGC TCG AGG CAG CCTAGC CAG TC-3’,帶限制性內(nèi)切酶Xho I酶切位點;以pGEX-4T-3/PEX215質(zhì)粒為模板,用引物PEX466sense與PEX660antisense一起擴增人MMP2 cDNA 1685bp~2269bp片段,即585bp的PEX cDNA片段,編碼人MMP2從466aa到660aa的PEX蛋白; 3)真核表達質(zhì)粒pSecTag A/PEX的構(gòu)建 將PCR擴增的PEX cDNA片段和載體pSecTag A經(jīng)Sfi I和XhoI雙酶切后,經(jīng)連接酶連接后構(gòu)建質(zhì)粒pSecTag A/PEX,該質(zhì)粒表達的PEX蛋白N端帶有Ig κ-鏈前導(dǎo)鏈,C端帶有Myc表位標(biāo)簽,lg κ-鏈前導(dǎo)肽可介導(dǎo)PEX分泌到胞外,Myc表位檢測標(biāo)簽可用于外源性PEX蛋白的檢測以區(qū)別于內(nèi)源性PEX蛋白; 步驟2:腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-PEX的構(gòu)建 根據(jù)人MMP2序列(Genbank Accession No.:NM_004530)及其閱讀框架、pShuttle-CMV載體多克隆位點以及編碼框架,設(shè)計二條PCR反應(yīng)引物,其中上游引物PEX466leader序列為5’-GATCAGCGGCCGCCCACCATGGAGACAG-3’,帶完整Kozak翻譯起始序列和限制性內(nèi)切酶NotI酶切位點,下游引物PEX660Myc序列為5’-GTGCAAGCTTCAGCTATTCAGATCCTC-3’,末端帶限制性內(nèi)切酶Hind III酶切位點和終止密碼子TGA;以步驟1構(gòu)建的質(zhì)粒pSecTag A/PEX為模板,利用PCR技術(shù),用上游引物PEX466leader和下游引物PEX660Myc擴增人MMP2 cDNA1685bp~2269bp片段,即585bp的PEX cDNA片段,編碼人MMP2從466aa到660aa的195aaPEX片段,并在表達的PEX N-端帶有Ig κ-鏈前導(dǎo)鏈METDTLLLWVLLLWVPGSTGD,C-端帶有Myc表位EQKLISEEDLN檢測標(biāo)簽,將PCR擴增得到的插入片段重組入腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV,構(gòu)建pShuttle-CMV-PEX質(zhì)粒; 步驟3:大腸桿菌中腺病毒的同源重組 將質(zhì)粒pShuttle-CMV-PEX用Pme I酶切線性化和磷酸化酶處理后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183,二者同源重組生成腺病毒pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX; 步驟4:陽性pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX(Ad-PEX)重組子的擴增 將確定陽性重組子的病毒載體pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH10B擴增,擴增后提取質(zhì)粒,該病毒能在細胞中表達N-端帶Ig κ-鏈前導(dǎo)肽、C-端帶Myc表位標(biāo)簽的PEX蛋白,Ig κ-鏈前導(dǎo)肽可誘導(dǎo)PEX分泌到胞外,Myc表位檢測標(biāo)簽可用于外源性目的蛋白的檢測以區(qū)別于腫瘤內(nèi)源性PEX; 步驟5:重組腺病毒Ad-PEX在HEK293細胞包裝成完整的腺病毒 將重組腺病毒酶切線性化后轉(zhuǎn)染入HEK293細胞包裝成完整的腺病毒。  
摘要 人PEX外泌型重組腺病毒的構(gòu)建方法和應(yīng)用,涉及一種人PEX外泌型重組腺病毒構(gòu)建方法。提供一種帶Myc標(biāo)簽的人PEX外泌型重組腺病毒構(gòu)建方法,步驟為質(zhì)粒pSecTag A/PEX的構(gòu)建:pGEX-4T-3/PEX215質(zhì)粒的構(gòu)建;PCR技術(shù)擴增人MMP2 C端片段PEX cDNA;真核表達質(zhì)粒pSecTag A/PEX的構(gòu)建。腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-PEX的構(gòu)建。大腸桿菌中腺病毒的同源重組。陽性pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX(Ad-PEX)重組子的擴增。重組腺病毒Ad-PEX在HEK293細胞包裝成完整的腺病毒?捎糜谥委熌[瘤等血管生成相關(guān)疾病的基因治療藥物。  
國際公布  
...
  • 上一篇文章:
  • 下一篇文章: 沒有了
  • 評論加載中...
    網(wǎng) 名: (必填項)
    評論內(nèi)容:
    關(guān)于我們 - 聯(lián)系我們 -版權(quán)申明 -誠聘英才 - 網(wǎng)站地圖 - 醫(yī)學(xué)論壇 - 醫(yī)學(xué)博客 - 網(wǎng)絡(luò)課程 - 幫助
    醫(yī)學(xué)全在線 版權(quán)所有© CopyRight 2006-2046, MED126.COM, All Rights Reserved
    浙ICP備12017320號-1
    百度大聯(lián)盟認證綠色會員可信網(wǎng)站 中網(wǎng)驗證