一、特異性抗原的檢測
檢測人T細胞的特異性抗原,曾采用抗人腦、抗人胸腺細胞和抗人T細胞等抗血清,通過細胞毒試驗或免疫熒光染色加以鑒定。自抗白細胞分化抗原的單克隆抗體問世以來,上述諸多方法均被新方法取而代之。常用以鑒定和檢測計數(shù)T細胞的表面分化抗原如表21-1所示。
表21-1 T胞表面主要CD抗原及其特異性
CD抗原 | 特 異 性 |
CD2 | E受體、全部T細胞和部分NK細胞 |
CD3 | 成熟T細胞 |
CD4 | T(輔助/誘導(dǎo))細胞、Mφ、HIV受體 |
CD8 | T(殺傷/抑制)細胞、NK細胞的亞型 |
CD25 | 活化T細胞、IL-2受體 |
用單克隆抗體檢測T細胞表面抗原的方法有兩大類,一類是用標記抗體著染,如免疫熒光法、酶免疫法、生物素-親和素(或鏈霉親和素)系統(tǒng)的ABC法以及免疫金銀染色法;另一類是用抗體致敏的紅細胞作花環(huán)試驗。兩類方法各有優(yōu)缺點。以下敘述有代表性的方法。
(一)間接免疫熒光法
本法是將分離獲得的外周血單個核細胞分別與抗相應(yīng)CD的單克隆抗體(如CD2、CD4、CD8)結(jié)合后,洗去游離的抗體,繼加熒光素標記的抗小鼠IgG抗血清,經(jīng)溫育結(jié)合后,洗去多余的標記抗體,取樣制片,用熒光顯微鏡觀察并計數(shù)約200個單個核細胞,以熒光陽性細胞與計數(shù)細胞總數(shù)之比,求得相應(yīng)CD抗原陽性的T百分率。如有條件,細胞經(jīng)熒光標記抗體著染后,用流式細胞儀計數(shù),快速而準確,但需要較多的投資,難以普及應(yīng)用。
(二)免疫細胞化學(xué)法
通常用酶免疫檢測法,如APAAP酶免疫橋聯(lián)法。為減少非特異性著染,可選用生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)試劑作ABC法染色。該類方法可用普通顯微鏡觀察,凡呈棕黃色的細胞為相應(yīng)CD抗原陽性細胞,計其占總淋巴細胞的百分率。本法簡便易行,不需特殊儀器,一般試驗室均可采用。
(三)抗體致敏細胞花環(huán)法
用相應(yīng)的CD單克隆抗體致敏醛化的紅細胞作為指示物,它與受檢的細胞混勻后,置室溫片刻,繼經(jīng)低速離心,移放室溫作短期溫育或4℃過夜后,重懸取樣涂片染色鏡檢。凡受檢細胞周圍粘附有3個或更多紅細胞的判為花環(huán)形成細胞,共計數(shù)100~200個細胞,以花環(huán)形成數(shù)與計數(shù)細胞總數(shù)之比為相應(yīng)CD抗原陽性細胞的百分率。本法需有相應(yīng)的致敏紅細胞試劑,受影響的因素較前兩法多。
二、特異性受體的檢測
T細胞表面有特異性綿羊紅細胞(E)受體和T細胞抗原識別受體(TCR),其中E受體曾廣泛被用作鑒定和計數(shù)T細胞的標志。當(dāng)人T細胞與綿羊紅細胞懸液按一定比例混勻后,置4℃至少2h或過夜,T細胞表面的E受體能與綿羊紅細胞結(jié)合而形成玫瑰花樣的花環(huán)(圖21-1),取樣涂片染色、鏡檢計數(shù)可得總花環(huán)形成北,亦即T細胞的百分率。如減少淋巴細胞與綿羊紅細胞的比例,兩者混合后,經(jīng)短時間的溫育即行取樣涂片鏡檢計數(shù),仍可見部分淋巴細胞形成花環(huán),稱為活性E(Ea)花環(huán),它可能代表T細胞的一個亞群,正常值僅為總E花環(huán)的1/3~1/2,約20%~40%。檢測Ea花環(huán)形成細胞比總E花環(huán)形成細胞更能反映受檢者的細胞免疫水平。這類花環(huán)試驗多種多樣,因操作簡便易行,曾被廣泛使用,但影響因素較多,操作稍有不同,所得結(jié)果差異較m.52667788.cn/shouyi/大,因此漸被檢測CD抗原方法m.52667788.cn/sanji/所取代。
圖21-1 顯微鏡下的E花環(huán)
有些哺乳動物與人類相似,其外周血中T細胞能與某種或某幾種動物的紅細胞結(jié)合形成花環(huán),其匹配如牛、豬淋巴細胞與綿羊紅細胞,狗-人、貓-豚鼠、豚鼠-兔,因此這些相應(yīng)的花環(huán)試驗可以作為實驗研究細胞免疫有用的技術(shù)之一。T細胞抗在識別受體分α/βTCR和γ/δTCR,可用相應(yīng)單克隆抗體作免疫熒光檢測,現(xiàn)僅作為研究的工具。