膠體鐵（Ferric Colloid)是一種陽(yáng)離子膠體，可通過普魯士藍(lán)反應(yīng)呈色，其顆粒有一定的大小及電子密度，最初被用于光鏡及電鏡下定位組織中的陰離子部位（Hale,1946Seno,etal, 1983,Murakami， et al 198m.52667788.cn/wszg/6)。1989年日本學(xué)者Seno等在抗體分子上標(biāo)記了膠體鐵，將膠體鐵引入免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（Seno,et al. 1989)。楊守京等在膠體的制備方法及其標(biāo)記物的純化等方面做了改進(jìn)，成功地用于流行性出血熱病毒抗原的檢測(cè)（楊守京，等，1992)。該方法具有較高的特異性與敏感性，背景染色干凈。
早期制備的膠體鐵作為陽(yáng)離子膠體是用于檢查組織中陰離子的定位，其制備主要是通過三氯化鐵（FeCl3)的煮沸完成的，如有：（1)FeCI3直接煮沸（Hale ,1946):(2)FeCl3溶于甘氨酸和氨水的混和液中（Rinehart,1951):(3)FeCl3倒入煮沸的二甲坤酸鈉溶液中（Seno.et al,1983)�；騀eCl3與二甲砷酸溶液一起煮沸（Seno ,et al.1985)其后，制備方法不斷改進(jìn)，1986年Murakam 等用水合聯(lián)胺二甲砷酸-FeCl3煮沸法制備出微細(xì)顆粒膠體鐵（Fine-granular cationic iron colloid),膠體顆粒�。�0.5～1nm),從而使其穩(wěn)定性及穿透能力大大增加(Murakarmi,et al.1986)。用二甲砷酸代替二甲砷酸鈉也可以獲得同樣膠體，具體步驟如下：在60ml 0.1mol/LFeCl33ml，將混合物加熱煮沸至變成深棕紅色為膠體砷酸鐵。室溫冷卻后，再以二倍于原體積的0.1mol/LpH7.4的二甲砷酸鈉緩沖液（Cacdylate sodium Buffer pH7.4,CB)稀釋，即可進(jìn)行抗體標(biāo)記。該方法制備的鐵膠體呈深紅色，顆粒大小1nm左右，在pH4～8范圍內(nèi)穩(wěn)定，4℃可存放一個(gè)月以上，室溫存放半個(gè)月，陰離子定位分布同Murakami等的膠體鐵，與IR-COO-有較強(qiáng)的親和力，但不與IR-NH+結(jié)合。
膠體鐵的等電點(diǎn)為7.8至7.9,在pH7.4時(shí)通過離子鍵能與抗體IgG(pH5.8～7.3)結(jié)合而不影響抗體活性,在此條件下,Seno＇對(duì)Hale＇膠體鐵進(jìn)行了抗體標(biāo)記,并成功用于免疫細(xì)胞化學(xué)染色(Sem.52667788.cn/sanji/no,et al.1989),抗體標(biāo)記時(shí),用0.1mol/L碳酸鉀將膠體的pH調(diào)至7.4按每毫升脫體鐵0.2～1mg的蛋白量,將IgG在電磁攪拌下逐滴加入到膠體鐵,攪拌5min后,通過CB平衡的Amber liaht CC-50層析柱,CB洗脫純化.作者在膠體鐵的制備方法進(jìn)行了改進(jìn),吸收了Murakami等膠體的優(yōu)點(diǎn),所制備的膠體鐵,顆粒小,穩(wěn)定性高,其pH值近中性,標(biāo)記效果好,CM-sephadex C-50(Pharmacia)可取代Amberlight CG-50用于純化標(biāo)記抗體(楊守京,等,1992)。
用免疫斑點(diǎn)法或免疫細(xì)胞化學(xué)染色等方法可鑒定抗體的標(biāo)記效果
1．免疫斑點(diǎn)法 在處理好的硝酸纖維素膜上分別滴加100～10-7系列稀釋的抗原，斑點(diǎn)直徑0.25cm, 空氣中干燥，80℃多聚甲醛蒸氣固定1h，然后分別以膠體鐵標(biāo)記的抗體一步法或用橋抗聯(lián)接膠體鐵標(biāo)記物的間接法染色，普魯士藍(lán)呈色觀察。一步法所難檢測(cè)到的抗原量為10-２～10-３μg,間接法 敏感性至少增加10倍（10-３～10-４μg)。
2．免疫細(xì)胞化學(xué)染色法 步驟同下，方法敏感性同免疫金銀法（IGSS)，優(yōu)點(diǎn)是背景干凈。
（1)組織切片脫蠟入水，0.01mol/l pH7.4 PBS洗；
（2)用4%正常羊血清封閉組織37℃ ，30min。
（3)分別以第一抗體孵育組織，4℃24h，PBS振洗10min×3；
（4)用膠體鐵標(biāo)記的第二抗體37℃孵育30min或用橋抗聯(lián)接膠體鐵標(biāo)記物；
（5)蒸餾水洗；
（6)以1%的亞鐵氰化鉀與1%鹽酸混合液顯色20in；
（7)自來(lái)水洗 ；
（8)核固紅染核，脫水，透明、封片。
以該方法染色，陽(yáng)性為藍(lán)色，胞核為紅色。
膠體鐵的呈色產(chǎn)物亞鐵氰化鐵是一絡(luò)合物（解離常數(shù)1×10-35)，一經(jīng)形成，難以再與其它化學(xué)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。藍(lán)色的亞鐵氰化鐵與棕色的DAB產(chǎn)物及黑色的銀顆粒顏色對(duì)比明顯，因此強(qiáng)結(jié)合免疫酶及IGSS進(jìn)行光鏡下抗原的雙標(biāo)及多標(biāo)記。膠體鐵（顆粒1nm)標(biāo)記抗體直徑比常用膠體金（5～40nm)及鐵蛋白標(biāo)記抗體（12nm)小，因而對(duì)固定組織具有更好的穿透力，可用于抗原的超威結(jié)構(gòu)定位，尤其是免疫電鏡的包埋前染色。結(jié)合免疫酶及不同大小膠體金標(biāo)記抗體，還可用于抗的雙標(biāo)記及多標(biāo)記。
非特異性背景染色是免疫組化染色過程中經(jīng)常遇到的問題。組織中的內(nèi)源性過氧化酶活性及色素常會(huì)干擾免疫過氧化酶染色；而膠體金非特異性吸附組織是構(gòu)成IGSS背景染色的主要原因。膠體鐵與抗體結(jié)合呈電中性后，很少再與組織發(fā)生吸附，并且其染色不受內(nèi)源酶活性的干擾。普魯士藍(lán)反應(yīng)只顯示標(biāo)記的三價(jià)鐵，不能顯示組織中內(nèi)源性二價(jià)鐵（除外含鐵血黃素，但可通過連續(xù)切片H·E染色對(duì)照排除)，因而背景干凈。另外免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)和組織染色結(jié)果表明，免疫膠體鐵間接法敏感性與IGSS基本相同但高于ABC染色，從上述兩方面看，該方法要優(yōu)于免疫酶及免疫金銀染色。
