實用免疫細胞與核酸:第三節(jié)　膠體金的制備方法

膠體金溶液的制備有許多種方法，其中最常用的是化學還原法，基本的原理是向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子變成金原子。目前常用的還原劑有：白磷、乙醇、過氧化氫、硼氫化鈉、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等，下面分別介紹制備不同大小顆粒的膠體金溶液。

一、制備膠體金的準備

（一)玻璃器皿的清潔

制備膠體金的成功與失敗除試劑因素以外玻璃器皿清潔是非常關鍵的一步。如果玻璃器皿內(nèi)不干凈或者有灰塵落入就會干擾膠體金顆粒的生成，形成的顆粒大小不一，顏色微紅、無色或混濁不透明。我們的經(jīng)驗是制備膠體金的所有玻璃器皿先用自來水把玻璃器皿上的灰塵流水沖洗干凈，加入清潔液（重鉻酸鉀1000g,加入濃硫m.52667788.cn酸2500ml，加蒸餾水至10000ml)浸泡24h，自來水洗凈清潔液，然后每個玻璃器皿用洗潔劑洗3～4次，自來水沖洗掉洗潔劑，用蒸餾水洗3～4次，再用雙蒸水把每個器皿洗3～4次，烤箱干燥后備用。通過此方法的處理玻璃器皿不需要硅化處理，而直接制備膠體金。也可用已經(jīng)制備的膠體金溶液，用同等大不顆粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面，然后棄去，再用雙蒸水洗凈，即可使用，這樣效果更好，因為減少了金顆粒的吸附作用。

（二)試劑的配制要求

（1)所有配制試劑的容器均按以上要求酸處理洗凈，配制試劑用雙蒸餾水或三蒸餾水。

（2)氯化金（HauCl₄水溶液的配制：將lg的氯化金一次溶解于雙蒸水中配成1%的水溶液。放在4”c冰箱內(nèi)保存長達幾個月至1年左右，仍保持穩(wěn)定。

（3)白磷或黃磷乙醚溶液的配制：白磷在空氣中易燃燒，要格外小心操作。把白磷在雙蒸水中切成小塊，放在濾紙上吸于水份后，迅速放入已準備好的乙醚中去，輕輕搖動，等完全溶解后即得飽和溶液。儲藏于棕色密閉瓶內(nèi)，放在陰涼處保存。

二、制備膠體金的方法和步驟

（一)白磷還原法

1．白磷還原法（zSigmondy 1905年)

（1)取1%的HAuCl₄水溶液1ml，加雙蒸水99ml配成0.01%的HAuCl₄水溶液。

（2)用0.2mol/lK₂CO₃調(diào)pH至7.2。

（3)加熱煮沸騰，迅速加入0.5ml20%白磷的飽和乙醚溶液，振蕩數(shù)分鐘至溶液呈現(xiàn)橙紅色時即成。膠體金的顆粒直徑為3nm左右，大小較均勻。

2．白磷還原法（zSigmondy 1905及z Sigmondy Thiessen 1925)

（1)取0.6%的HAuCl₄水溶液2.5ml,加雙蒸水120ml 。

（2)用0.2mol/lK₂CO₃,調(diào)pH至中性。

（3)加入1/5飽和度的白磷乙醚溶液1ml（1份白磷4份乙醚)，在室溫振蕩約15min ，溶液呈紅褐色，再加熱至典型的葡萄酒紅色，加熱可使乙醚蒸發(fā)，膠體金液體內(nèi)過量的白磷通入空氣后被氧化，此方法獲得膠體金顆粒的直徑在5～12nm之間。

3．白磷還原法的改良法（Henegouwen1986)

（1)取20%飽和度白磷乙醚溶液0.5ml,加雙蒸水60ml 。

（2)用1%的HAuCl₄水溶液0.75ml,加0.1mol/l K₂CO₃0.6ml, 振蕩變成棕紅色。

（3)加熱煮沸，至溶液變成透明紅色。

使用上述方法增加還原次數(shù)使金顆粒直徑不斷增大，二者之間的關系見表5-1。

表5-1 膠體金顆粒大小與還原次數(shù)之間的關系

此方法主要優(yōu)點是簡化了制備不同大小的顆粒膠體金的手續(xù)和其它試劑的配制,經(jīng)濟、操作簡單。另外，在多次還原過程中氯化金不再形成新的金顆粒，只是在原先金粒子基礎上使它的直徑變大。第一次金顆粒起著“晶核”的作用。由于這一特點，制備的金顆粒相對均勻一致。

（二)抗體血酸還原法（Stathis and Fabrikanos 1958)

（1)將在4^℃預冷的1%HAuCl₄水溶液1ml,0.2mol/l K₂CO₃1.5ml、雙蒸水25ml混勻。

（2)在攪拌下加入1ml0.7%抗壞血酸水溶液，立即呈現(xiàn)紫紅色。

（3)加雙蒸水至100ml，加熱至溶液變?yōu)橥该骷t色為止。膠體金顆粒直徑為8～13nm。

（三)檸檬酸三鈉還原法（Frens 1973)

此方法是由Frens在1973年創(chuàng)立的，制備程序很簡單，膠體金的顆粒大小較一致，廣為采用。該法一般先將0.01%的HAuCl₄溶液加熱至沸騰，迅速加入一定量1%檸檬酸三鈉水溶液，開始有些藍色，然后淺藍、藍色，再加熱出現(xiàn)紅色，煮沸7～10min出現(xiàn)透明的橙紅色。各種顆粒的膠體金制備詳見表5-2。

表5-2 檸檬酸三鈉用量與膠體金顆粒直徑的關系

按照Frens法還可以制備出其它不同顆粒大小的膠體金出來。許多研究證明用該法制備膠體金時金顆粒的大小是檸檬酸三鈉用量的函數(shù)，基本的規(guī)律是檸檬酸三鈉用量多，膠體金顆粒直徑小，檸檬酸三鈉用量越少，腔體金顆粒直徑越大。

（四)鞣酸—檸檬酸三鈉還原法（Slot與Gueeze1985年)

該法是以1982年Muhlpfordt法為基礎，1985年Slot與Geuze對該法進行了改良，特點是通過改變鞣酸的用量制備出多種顆粒直徑的膠體金，而且顆粒的直徑均勻一致，很適合于雙標及多標研究。制備3nm、5nm、10nm、15nm的膠體金顆粒見表5-3。

表5-3 鞣酸—檸檬酸三鈉還原法

操作步驟：

（1)根據(jù)所需要的膠體金顆粒分別配制A液和B液。

（2)將配制好的A、B兩液在水浴內(nèi)加熱到60℃，并通過控溫裝置使溫度保持穩(wěn)定。

（3)在電磁攪拌器上攪拌A液迅速加入B液，繼續(xù)加熱直至膠體金變成葡萄酒色，時間大約7～10min。在A、B兩液混合后可見溶液立即變成藍色，大約1～3min就變成紅色。

用鞣酸—檸檬酸三鈉還原法，檸檬酸三鈉主要為還原劑，而鞣酸則有雙重作用，一是還原作用，二是保護作用，控制“晶核”的形成過程，也就是說鞣酸的用量多少決定膠體金顆粒的大小形成，因此改變鞣酸的用量就可以改變膠體金的顆粒大小，達到制備不同直徑顆粒的膠體金之目的。

（五)乙醇超聲波還原法（Baigent and Muller 1980)

（1)1%HAuCl₄水溶濃0.2ml加入100ml雙蒸水。

（2)用0.2molK₂CO₃調(diào)pH至中性，再加入1ml乙醇。

（3)用20KC、125w超聲波探頭浸入溶液內(nèi)進行超聲振蕩，由此法制得的膠體金顆粒為6～10nm。

（六)硼氫化鈉還原法（Tschopp et al 1982)

（1)將預冷在4^℃的40ml雙蒸水中加入0.6ml 1%的HAuCl₄。

（2)再加入0.2molK₂CO₃，0.2ml。

（3)在攪拌下，迅速加入新鮮配制的硼氫化鈉水溶液（0.5mg/ml)0.4ml,一般重復加入3～5次，直至溶液的蘭紫色變?yōu)槌燃t色為至。然后再攪拌5min，獲得的金顆粒直徑在2～5nm之間。

（七)放射性膠體金的制備方法（Kent and Allen 1981)

（1)取0.01%HAuCl₄上水溶液100ml，加熱至沸騰。

（2)加入40μl¹⁹⁵Au。

（3)迅速加入4ml1%檸檬酸三鈉水溶液，5～7min出現(xiàn)透明的橙紅色。

（4)其含量為I×10⁶脈沖數(shù)/min。

（八)微波制備液體金方法。