流行性乙型腦炎（下稱乙腦)滅活疫苗是將乙腦病毒接種于地鼠腎細(xì)胞，培育后收獲病毒液，加入甲醛溶液將病毒殺死后制成。用于預(yù)防乙腦。
1 毒種
1.1 毒種來源
P3株病毒，每3～5年應(yīng)用新分離的乙腦流行株病毒檢查P3株的保護力，以了解該毒株的有效性。P3株干燥毒種由中國藥品生物制品檢定所分發(fā)。
1.2 毒種檢定
1.2.1 無菌試驗
毒種啟封和每次傳代后均需做無菌試驗，合格者方可使用。
1.2.2 病毒滴定
每正代必須用體重7～9g小白鼠進行腦內(nèi)滴定，滴度≥9.0LogLDm.52667788.cn/wszg/50/1.0ml可用于生產(chǎn)。
1.2.3 純毒試驗
生產(chǎn)前和生產(chǎn)末期用小白鼠做腦內(nèi)法中和試驗，以鑒定毒種的特異性。所用特異性抗血清由中國藥品生物制品檢定所提供。中和指數(shù)必須在500以上。生產(chǎn)過程中如對毒種發(fā)生疑問，應(yīng)及時進行鑒定。
1.3毒種傳代
分正亞代傳遞。從檢定所取回的干燥毒種傳遞不超過15代稱正代，由正代傳遞一代直接用于生產(chǎn)稱亞代。每次用于傳代的毒種不得少于3個鼠腦。
傳代時選用體重7～9g健康小白鼠或乳鼠，腦內(nèi)接種病毒，72小時后選眼結(jié)膜正常，有典型痙攣戰(zhàn)粟、肢體麻痹的小白鼠，無菌取腦并進行無菌試驗。
1.4 毒種保存
鼠腦毒種收剖經(jīng)無菌試驗后立即保存于-60℃以下，無菌試驗通過后方可使用。亦可將鼠腦毒種研磨乳化制成10%腦懸液，分裝小瓶凍存于-60℃以下，無菌試驗合格后備用。
2 疫苗制造
2.1 細(xì)胞制備
2.1.1 地鼠
選用健康地鼠。如發(fā)現(xiàn)腎臟異�；蛴腥槊訝�腹水，應(yīng)廢棄。
2.1.2 細(xì)胞消化及培養(yǎng)
取腎剪碎，用適量的胰蛋白酶溶液消化。用營養(yǎng)液分散細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，分裝培養(yǎng)瓶，于37℃進行培養(yǎng)。營養(yǎng)液中牛血清含量不得超過8%。
2.1.3 外源因子檢查
每生產(chǎn)批細(xì)胞留5%（或不少于500ml)懸液作為對照細(xì)胞檢查外源病毒。該細(xì)胞除不接種病毒外，細(xì)胞濃度和處理均與生產(chǎn)過程平行進行，至原液收獲之日用顯微鏡觀察，應(yīng)無病變發(fā)生。并用0.2%～0.5%豚鼠紅細(xì)胞（4℃保存不超過7天)進行血吸附試驗，置4～8℃30分鐘判定結(jié)果，再置20～25℃30分鐘再次判定結(jié)果，均應(yīng)為陰性。如有可疑病變或血吸附可疑陽性，在同種細(xì)胞上繼續(xù)盲傳，如傳出病毒，該批細(xì)胞制備的疫苗應(yīng)予廢棄。
2.2 病毒接種和培育
挑選生長良好的細(xì)胞瓶，充分淋洗細(xì)胞后加入適量維持液，接種病毒，病毒量不得＞7.0LogLD50/1.0ml。在適當(dāng)溫度下培育適當(dāng)時間，棄去病毒培養(yǎng)液，換以新維持液，繼續(xù)培育一定時間。
疫苗生產(chǎn)過程中不得加青霉素或其他β內(nèi)酰胺類抗生素。
2.3 原液
2.3.1 過濾
選擇有典型細(xì)胞病變的培養(yǎng)瓶，經(jīng)肉眼檢查無菌者進行澄清過濾，細(xì)胞質(zhì)量好時，可再加入新維持液，繼續(xù)培育，再次收獲病毒液。
2.3.2 病毒滅活
過濾后的原液，于取出無菌試驗和病毒滴定樣品后加入甲醛溶液，其最終濃度不得超過0.05%，置適當(dāng)溫度下一定時間滅活病毒。過濾后加入硫柳汞防腐劑，其最終濃度不得超過0.01%。
2.3.3 原液檢定
2.3.3.1 無菌試驗
按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。
2.3.3.2 病毒滴定
每個滴定批代表疫苗不得超過15萬ml，將樣品10倍系列稀釋，取至少3個稀釋度，每個稀釋度用體重7～9g小白鼠4只，每只腦內(nèi)接種0.03ml，逐日觀察，3日內(nèi)死亡者不計，觀察14天，滴度≥7.0LogLD50/1.0ml判為合格，不合格者可重試一次。
2.4 半成品
2.4.1 半成品取樣
無菌試驗合格及病毒滅活到期的疫苗原液，取樣做滅活試驗、效力試驗和無菌試驗。每次解剖的地鼠制備的疫苗為一生產(chǎn)批，按生產(chǎn)批進行檢定，但每批滅活試驗代表疫苗量不得超過15萬ml，每批效力試驗代表疫苗量不得超過100萬ml。無菌試驗按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。
2.4.2 半成品檢定
2.4.2.1 滅活試驗
（1)動物法：將樣品腦內(nèi)接種體重12～14g小白鼠8只，每只 0.03ml，同時腹腔接種0.5ml，為第一代；7天后將第一代小白鼠處死3只，取腦做成10%懸液，腦內(nèi)接種6只小白鼠，為第二代；7天后將第二代小白鼠處死3只，同法接種m.52667788.cn/sanji/6只小白鼠，為第三代。從接種之日起逐日觀察14天，每代小白鼠除處死和接種后3日內(nèi)非特異性死亡者外，全部健存為合格。
若傳代3日后有個別小白鼠死亡，應(yīng)立即取死鼠腦乳化成懸液再接種3只小白鼠，觀察14天，該3只小白鼠健存仍判為合格。如仍有小白鼠死亡，該批疫苗應(yīng)重試，重試合格后仍可使用。若傳出活病毒應(yīng)重試，查明原因。必要時繼續(xù)滅活并進行滅活試驗，若仍傳出活病毒，該批半成品應(yīng)予廢棄。
（2)細(xì)胞培養(yǎng)-動物法：將樣品25ml透析24小時后，接種地鼠腎細(xì)胞或BHK21細(xì)胞，每ml樣品接種不少于3cm2細(xì)胞片，置培養(yǎng)病毒的溫度下培育14天，不得有細(xì)胞病變出現(xiàn)。到期的培養(yǎng)液腦內(nèi)接種體重7～9g小白鼠10只，每只0.03ml，觀察14天，應(yīng)全部健存。若有死亡者應(yīng)查明原因或重試，重試合格者仍可使用。不合格者應(yīng)廢棄。
以上兩種滅活試驗方法可任選一種。
2.4.2.2 效力試驗
采用免疫小白鼠中和抗體測定法。中和抗體測定采用蝕斑減少試驗。參考疫苗（RA和RB)及中和試驗陽性血清由中國藥品生物制品檢定所提供。
將被檢苗（T)和參考苗（R)稀釋成1∶32腹腔免疫體重12～14g小白鼠10只，每只0.5ml，免疫2次，間隔7天，第二次免疫后7天采血，分離血清，同組小白鼠血清等量混合，56℃30分鐘滅活，備用。
稀釋陽性血清、被檢苗血清和參考苗血清，分別與稀釋好的病毒（約200PFU/0.4ml)等量混合，同時將稀釋好的病毒再1∶2稀釋，作為病毒對照，置37℃水浴作用90分鐘，接種6孔板BHK21細(xì)胞，每孔0.4ml，37℃孵育90分鐘，加入含甲基纖維素的培養(yǎng)基覆蓋物，于CO2孵箱中培育5天，染色，蝕斑計數(shù)，計算被檢苗和參考苗組對病毒對照組的蝕斑減少率。病毒對照組的蝕斑平均數(shù)應(yīng)在50～150之間。
判定標(biāo)準(zhǔn)
（1)合格：T≥（RA+RB)/2-0.33
（2)重試：（RA+RB)/2-0.66＜T＜（RA+RB)/2-0.33
（3)不合格：T＜（RA+RB)/2-0.66
2.4.2.3 殘余牛血清蛋白含量測定
用檢定所認(rèn)可的試劑和方法測定，殘余牛血清蛋白含量應(yīng)≤50ng/ml。
3 成品檢定
3.1 外觀檢查
疫苗應(yīng)為橘紅色透明液體，無異物，無沉淀。
3.2 無菌試驗
按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。
3.3 化學(xué)檢查
按《生物制品化學(xué)檢定規(guī)程》進行。pH值為7.2～8.0。游離甲醛不高于0.05%，硫柳汞不高于0.01%。
3.4 安全試驗
每批疫苗腹腔注射體重18～20g小白鼠4只，每只0.5ml，逐日觀察3天，均應(yīng)健存，如有小白鼠死亡，除檢查原因外，應(yīng)立即進行重試。
3.5 亞硫酸氫鈉檢定
分裝后的亞硫酸氫鈉要進行含量測定和無毒性試驗。含量不得低于原配濃度的60%。無毒性試驗系將樣品稀釋成1∶100，腹腔注射體重18～20g小白鼠2只，每只0.5ml，觀察5日，應(yīng)全部健存。
4 保存與效期
保存于2～8℃暗處。自效力檢定合格之日起效期為2年。
