第二節(jié)    分子診斷

    長期以來，疾病的診斷主要依據(jù)病史、癥狀、體征和各種輔助檢查，如血液學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)乃至物理學(xué)檢查等。然而，上述檢查方法都具有其各自的局限性，使得許多疾病未能被及時準(zhǔn)確地診斷，從而延誤了治療良機(jī)。因為許多外科疾病在病人出現(xiàn)癥狀、體征及生化改變之前就已存在相當(dāng)一段時間，所以人們一直在盼望能找到一種技術(shù)，在疾病一旦發(fā)生，甚至尚未出現(xiàn)癥狀、體征及生化改變之前，就能作出診斷；對于某些可能的致病因素，包括食品、水質(zhì)、環(huán)境中存在的病原體，人們也期望能有簡單準(zhǔn)確的方法及時進(jìn)行檢測。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使人們渴望已久的上述愿望得以實現(xiàn)，這種在分子生物學(xué)理論和技術(shù)發(fā)展基礎(chǔ)上建立起來的一門全新的診斷技術(shù)就是分子診斷。
    生物大分子主要指核酸（DNA和RNA）和蛋白質(zhì)，通過從分子水平上完成DNA, RNA或蛋白質(zhì)檢測，從而對疾病作出診斷的方法稱為分子診斷，目前常用的方法有基因診斷和腫瘤標(biāo)志物檢測兩種。

   （一）基因診斷

    基因診斷是用分子生物學(xué)的理論和技術(shù)，通過直接探查基因的存在狀態(tài)或缺陷，從基因結(jié)構(gòu)、定位、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或翻譯水平分析基因的功能，從而對人體狀態(tài)與疾病作出診斷的方法�；�因診斷檢測的目標(biāo)分子是DNA或RNA，反映基因的結(jié)構(gòu)和功能。檢測的基因有內(nèi)源性（即機(jī)體自身的基因）和外源性（如病毒、細(xì)菌等）兩種，前者用于診斷基因有無病變，后者用于診斷有無病原體感染。
    基因診斷的意義在于不僅能對某些疾病作出確切診斷，如確定某些遺傳病，也能確定基因與疾病有關(guān)聯(lián)的狀態(tài)，如對疾病的易感性、發(fā)病類型和階段的確定等。就目前已經(jīng)開展的工作而言，外科領(lǐng)域的遺傳性疾病、遺傳易感性疾病、多種惡性腫瘤、感染性疾病、器官移植反應(yīng)等都可以用基因診斷的方法加以診斷。
    基因診斷的主要技術(shù)有核酸分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)和生物芯片技術(shù)。

   1．核酸分子雜交技術(shù)

   （1）原理
    具有一定互補(bǔ)序列和核昔酸單鏈在液相或固相中按堿基互補(bǔ)配對原則締合成異質(zhì)雙鏈的過程，稱為核酸分子雜交。雜交的雙方是待測核酸序列和探針序列。應(yīng)用該技術(shù)可對特定DNA或RNA序列進(jìn)行定性或定量檢測。

   （2）基因探針及其標(biāo)記
    基因探針是一段與待測DNA或RNA互補(bǔ)的核昔酸序列，可以是DNA或RNA，長度不一，可為完整基因，也可為其中一部分。根據(jù)探針的來源和性質(zhì)分為基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針和人工合成的寡核昔酸探針。作為探針至少必須滿足兩個條件，一是應(yīng)為單鏈（或通過變性形成單鏈），二是應(yīng)帶有可被示蹤和檢測的標(biāo)記。有了合適的探針，就有可能檢測出目的基因，觀察有無突變，也可根據(jù)探針的結(jié)合量進(jìn)行定量檢測。選擇探針最基本的原則是要有高度特異性，其次也需考慮到制備探針的難易性和檢測手段的靈敏性等其他因素。

   （3）常用核酸分子雜交技術(shù)
    ①Southern印跡雜交；②Northern印跡雜交；③斑點雜交（ dotblotting）；④原位雜交（in situ hybridization）；⑤夾心雜交（三明治雜交）；⑥液相雜交。

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