三、ICC在細(xì)胞功能研究中的應(yīng)用
形態(tài)學(xué)研究目的之一是揭示組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征及其功能意義。利用ICC顯示給與細(xì)胞增殖標(biāo)記物，是組織細(xì)胞學(xué)研究中形態(tài)和功能相結(jié)合的重要手段之一。目前常用的細(xì)胞增殖標(biāo)記物有4種，Brdu (5—bromo—2--deoxyuridine), DNA polymerase α,PCNA （Proliferating cell nuclear antigen),Ki—67 等，相對(duì)應(yīng)的4種單克隆抗體均有商品出售。因組織細(xì)胞內(nèi)無(wú)內(nèi)源性Brdu存在，所以Brdu應(yīng)用較廣。Brdu為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期)，活體注射或細(xì)胞培養(yǎng)加入，而后利用抗Brdu單克隆抗體，ICC染色，顯示增殖細(xì)胞。同時(shí)結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物，雙重染色，可判斷增殖細(xì)胞的種類(lèi)，增殖速度，對(duì)研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有重要意義。
筆者在觀察大鼠小腸上皮細(xì)胞增殖、代謝時(shí)，一次腹腔注射Brdu（Sigma)4mg/150～200g體重，分別在給藥后1h和1、2、3、5、7天取小腸，應(yīng)用抗Brdu抗體，ICC染色，可見(jiàn)腸上皮細(xì)胞從腸腺至絨毛頂端增生移行。在計(jì)數(shù)免疫活性細(xì)胞研究中，一次注射Brdu后，計(jì)數(shù)瞬間進(jìn)入S期細(xì)胞數(shù)或連續(xù)多次注射Brdu，計(jì)數(shù)注射Brdu期間進(jìn)入S期細(xì)胞的總和。另外在臨床上，術(shù)前或術(shù)中給與Brdu，判斷腦腫瘤細(xì)胞分化程度、惡性度等亦較常用。
摻入雙鏈DNA內(nèi)的Brdu，以氫鏈與腺嘌呤結(jié)合，不能直接與抗Brdu抗體反應(yīng)，需經(jīng)解鏈?zhǔn)笲rdu暴露方能被染色。常用的解鏈方法為鹽酸加熱、蛋白酶處理等，使DNA雙鏈部分單鏈化，抗Brdu小鼠單克隆抗體與增殖細(xì)胞核內(nèi)的Brdu結(jié)合，再經(jīng)酶標(biāo)抗小鼠IgG抗體孵育、呈色，顯示進(jìn)入S期細(xì)胞的情況。
鹽酸和蛋白酶處理等可引起其它抗原或組織形態(tài)發(fā)生變化。為此，Conchoroff(1985)等制備了一種單克隆抗體（Bu—1)，其培養(yǎng)液上清能與雙鏈DNA的Brdu反應(yīng)，因?yàn)榕囵B(yǎng)液上清中含有DNA酶，可分解雙鏈DNA，顯露Brdu，達(dá)到染色目的。筆者采用戊二醛固定后，胃蛋白酶—鹽酸處理，亦得到了良好的染色結(jié)果。簡(jiǎn)述染色步驟如下（Matsuna,1989)：
（1)冰凍切片/石蠟切片準(zhǔn)備同前。
（2)TBS沖洗，Baker’s液固定10min，室溫。
�。�3)TBS沖洗，1%戊二醛固定5～10min，室溫。
�。�4)雙蒸水沖洗，0.006%(冰凍切片)或0.02%(石蠟切片)胃蛋白酶/0.01mol/l HCl,37℃，10min。
�。�5)雙蒸水沖洗，4N HCl 30min，室溫。
（6)PBS充分沖洗，使切片pH回至中性。
�。�7)封閉性阻斷劑20min，室溫。
（8)抗Brdu抗體孵育1～2h室溫或4℃過(guò)夜。
�。�9)PBS沖洗，HRP標(biāo)記抗小鼠IgG抗體45min，室溫。
�。�10)PBS沖洗，DAB/H2O2呈色。
�。�11)輕度蘇木精復(fù)染，脫水透明，封片同前。分裂增殖細(xì)胞核呈棕褐色。
采用雙重或多重染色、觀察何種細(xì)胞分裂增殖時(shí)，首先應(yīng)染色其它抗原物質(zhì)，最后顯示Brdu。通常在第一種抗體呈色后，再經(jīng)1%戊二醛固定5～10min，重復(fù)上述程序，均可獲得較滿(mǎn)意的染色結(jié)果，分裂細(xì)胞核呈棕褐色；顯示其它抗原用ALP標(biāo)記抗體，則細(xì)胞漿為紅色（FR)或藍(lán)色（FB)。
四、 ICC在原位雜交技術(shù)中的應(yīng)用
傳統(tǒng)的ICC法主要用于檢測(cè)組織細(xì)胞中含有何種物質(zhì)，根據(jù)該物質(zhì)的作用，推測(cè)其組織細(xì)胞生理、病理意義。但該物質(zhì)來(lái)自何處，是否是陽(yáng)性細(xì)胞合成往往較難判斷，結(jié)合免疫電鏡及雙重染色等方法，在某種程度上，有助于推斷該物質(zhì)的來(lái)源。然而通常ICC法顯示的是組織細(xì)胞已經(jīng)合成的物質(zhì)（過(guò)去時(shí))，本身不能說(shuō)明陽(yáng)性組織細(xì)胞目前的功能狀態(tài)，亦無(wú)法預(yù)測(cè)細(xì)胞將合成何種物質(zhì)，發(fā)揮什么功能，因此，單純的ICC法存在著被動(dòng)性。
近年來(lái)，ICC法與原位雜交技術(shù)結(jié)合，使細(xì)胞內(nèi)活性DNA可視化，直接顯示某染色體上，何種基因活性化或非活性化，描述組織細(xì)胞現(xiàn)在的狀態(tài)，同時(shí)亦可預(yù)知未來(lái)組織細(xì)胞將合成何種物質(zhì)，發(fā)揮哪些功能等，直接觀察組織細(xì)胞的時(shí)空改變，這在病理生理研究中有著重要意義，為形態(tài)學(xué)研究開(kāi)辟了令人矚目的前景。
眾所周知，機(jī)體內(nèi)不同的蛋白質(zhì)發(fā)揮其特定的功能，與其氨基酸序列密切相關(guān)，而它的氨基酸序列又是DNA通過(guò)mRNA轉(zhuǎn)錄控制的。因此檢測(cè)該DAN/mRNA的分布，可判斷組織細(xì)胞的功能狀態(tài)。為在組織細(xì)胞水平檢測(cè)DNA/mRNA等一定堿基序列的核酸存在與否，Gall（1969)等建立了原位雜交方法（詳見(jiàn)第二十章 )。
在檢測(cè)某種特定的蛋白質(zhì)在哪一類(lèi)細(xì)胞內(nèi)合成時(shí)，常常應(yīng)用連續(xù)切片或鏡影切片，原位雜交法顯示合成該蛋白質(zhì)的mRNA，ICC法染色其蛋白質(zhì)抗原，二者存在于同一細(xì)胞時(shí)，具有較強(qiáng)的說(shuō)服力。同一切片進(jìn)行上述雙重染色時(shí)，原位雜交步驟中，大多數(shù)抗原物質(zhì)的抗原性往往易被破壞，所以最好在ICC染色后再進(jìn)行原位雜交染色。ICC染色中，抗體內(nèi)含有RNase等可能破壞細(xì)胞內(nèi)的mRNA，為此應(yīng)選用精制IgG抗體，并加入500u/ml肝素抑制RNase。肝素系酸性多糖，其化學(xué)性質(zhì)與核酸類(lèi)似，能夠與以核酸為底物的酶（RNase)結(jié)合，從而保護(hù)mRNA免受破壞。另外，ICC染色以DAB呈色時(shí)，核酸探針易吸附于DAB產(chǎn)物上，需注意。
近年隨著細(xì)胞工程的進(jìn)步，ICC、原位雜交技術(shù)將在細(xì)胞生物學(xué)、組織學(xué)、遺傳學(xué)、病毒學(xué)、臨床疾病診斷等各個(gè)領(lǐng)域，得到更廣泛地應(yīng)用。
