（二)應(yīng)用生物素標(biāo)記DNA探針-PA-gold電鏡雜交技術(shù)（Binder et al,1986)
1．固定 現(xiàn)認(rèn)為應(yīng)用4%多聚甲醛加0.1%戊二醛在磷酸緩沖液中（pH7.4)，為較理想的固定劑，也有主張單純用4%多聚甲醛的，因經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明如應(yīng)用高濃度4%的戊二醛比用多聚甲醛樣品其雜交率減低60%。但作者認(rèn)為應(yīng)用少量戊二醛可較好的保持細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)。也有報(bào)告用酒精/醋酸混合液的。多聚甲醛-戊二醛固定時(shí)間在15min至1h。然后放入Ringer氏液或PBS，在4℃含7%蔗糖的0.15mol/L磷酸緩沖液中儲存過夜。
2．脫水 次日，用0.15mol/L磷酸緩沖液（pH7.4)沖洗30min，然后進(jìn)行脫水，①65%乙二醇，0℃，60min；②80%乙醇-35℃，120min；③100%K4M：80%乙醇 =1：1，-35℃，120min；④100%K4M：80%乙醇=2：1，-35℃，60min；⑤100%K4M -35℃，過夜。
3．包埋 按照Roth et al（1981)，組織塊包埋于盛有K4M的膠囊中，在-35℃紫外線燈（波長360nm)照射聚合24～48h。取出后置室溫，用紫外線燈繼續(xù)照射24h，使變硬易于進(jìn)行超薄切片。膠囊短期可保存于室溫，如需長期保存，宜置于-70℃冰箱中，可保存近1年。
K4M配制（中等硬度)
交聯(lián)接劑（cross-linker) 2.7mg
單體（monomer) 17.3mg
引發(fā)劑（initiator) 0.10mg
可根據(jù)硬度需要調(diào)整各化合物比例。增加交聯(lián)劑的量，組織塊的硬度增加。
4．切片超薄切片50～60nm，撈于有覆有Formavar和碳膜的鎳網(wǎng)上。
5．組織前處理和預(yù)雜交用含0.2mol/l Tris緩沖液的0.1mol/L甘氨酸（Ph7.4)沖洗15min，以除去醛類固定劑對雜交和檢測的影響，然后2×SSC沖洗15min，再用變性液（70%去離子甲酰胺，2×SSC)在65℃處理樣品5～10min，以達(dá)到變性的目的。變化后的樣品在預(yù)雜交液中（50%去離子甲酰胺，0.5mol/l NaCl, 10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA,pH7.5)37℃預(yù)處理15min。
6．雜交鎳網(wǎng)載有切片面覆蓋于雜交液滴（約20μl)上，置于濕盒內(nèi)37℃，1～2h。雜交液成份與光鏡原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)相同（詳見第二十章 )，如為DNA探針須在沸水中先煮2～3min，以使之變性，然后迅速移至冰浴。
整個(gè)雜交過程須注意防止鎳網(wǎng)上的雜交液干掉。
7．雜交后漂洗
含50%甲酰胺的2×SSC液 37℃ 30min
含50%甲酰胺的1×SSC液室溫30min
無甲酰胺的1×SSC液室溫20min
樣品置1×SSc 4℃過夜
0.01mol/L PBS(pH7.2) 室溫 10min
4%BSA 封閉 15min
8．羊抗生物素IgG抗體（sigma)1：100（稀釋用PBS液：2%NaCl, 0.05% KCl, 0.05% KH2PO4, 0.278% Na2HPO4,另加300mmol/L NaCl, 0.5% Triton X-100)室溫反應(yīng)2h。醫(yī)學(xué) 全在.線提供m.52667788.cn
9．含0.1% BSA的PBS液洗3×30min。
10．兔抗羊IgG的IgG相連10nm膠體金（Sigma)1：100（稀釋用1%BSA緩沖液：20mmol/l Tris –HCl, pH8.2,0.9% NaCl, 0.02mol/L疊氮鈉，0.5%Triton X-100),室溫反應(yīng)1h。
11．1%BSA緩沖液3×30min，PBS（pH7.2)15min，蒸餾水洗5min，空氣干燥。
12．醋酸雙氧鈾染色20min，檸檬酸鉛染色15min，空氣干燥后電鏡觀察。
應(yīng)用本法標(biāo)記有如下優(yōu)點(diǎn)：（1)可獲迅速的信號檢測；（2)形態(tài)學(xué)保存較好；（3)與放射性同位素原位分子電鏡雜交技術(shù)的信/噪比例相近。是目前公認(rèn)在電鏡水平應(yīng)用同位素標(biāo)記原位雜交技術(shù)較為理想的方法。膠體金顆粒電子密度高，明顯地區(qū)別于非特異性染色與污染，能達(dá)到較為滿意的超微結(jié)構(gòu)定位。本技術(shù)的難點(diǎn)在于：①實(shí)驗(yàn)周期長；②親水性低溫包埋劑制作切片，由于親水性強(qiáng)，撈取比較困難，切片易于破裂；③探針的純度與雜交后徹底的漂洗，這是本實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)系，而徹底的漂洗又易導(dǎo)致鎳網(wǎng)切片的破裂，作用推薦應(yīng)用大量漂洗液或漂洗中設(shè)置多個(gè)漂洗杯，勤換漂洗液，或用軟塑料瓶加筆狀噴頭，增加水壓等方法，但不論漂洗或噴水沖洗都必須注意水流與網(wǎng)面平行而不能垂直，否則更易導(dǎo)致切片的破裂。④雜交時(shí)間：Binder等證明雜交1h即可出現(xiàn)特異性，到5h之內(nèi)不斷增加。Lawrence和Singer（1985)實(shí)驗(yàn)也表明雜交后3～4h雜交時(shí)特異性就可達(dá)到最大值，雖然此后雜交仍繼續(xù)進(jìn)行，雜交率并不再增加。焦仁杰等（1992)對整裝細(xì)胞的試驗(yàn)也與上述實(shí)驗(yàn)相同，他們發(fā)現(xiàn)雜交4h和雜交20h相當(dāng)，但前者的結(jié)構(gòu)保存要好得多。他們實(shí)驗(yàn)表明，切片標(biāo)本的雜交時(shí)間大約需9～10h。因此，選擇最短而又最有效的雜交時(shí)間對有效地保持形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)是十分重要的。Binder認(rèn)為生物素PA-Gold電鏡雜交技術(shù)所需理想雜交時(shí)間為1～2h。⑤應(yīng)用含甲酰胺（formamide)的緩沖液漂洗易導(dǎo)致金粒聚集的非特異性背景，因此Binder在實(shí)驗(yàn)后建議試用以PBS緩沖液漂洗5×10min代替含甲酰胺的鹽液，經(jīng)證明可避免或減少這種非特異性染色；⑥多數(shù)作者發(fā)現(xiàn)應(yīng)用K4M包埋劑在電鏡雜交技術(shù)是最理想的，其結(jié)果可與無包埋劑的培養(yǎng)細(xì)胞涂片、染色體鋪片等的信/噪比值相等。
雖然生物素-PA-Gold電鏡雜交技術(shù)在K4M包埋切片獲得了較為滿意的結(jié)果，但Lawarence和singer（1985)在比較了三種檢測系統(tǒng)的信/噪（signal/Noise,S/N)得到的結(jié)果是32P標(biāo)記為70、3H標(biāo)記為20、而生物素標(biāo)記的S/N值最低，為10。Webster等（1987)同時(shí)比較了生物素標(biāo)記P0-HRP糖蛋白cDNA探針（包埋前染色)和生物素標(biāo)記P0-糖蛋白cDNA探針-蛋白A-膠體金（包埋后染色)電鏡雜交技術(shù)，觀察15天大鼠三叉神經(jīng)節(jié) 雪旺氏細(xì)胞髓鞘的標(biāo)記，固定劑應(yīng)用PLA溶液（4%多聚甲，15%（V/V)飽和苦味酸)和0.08%戊二醛（用磷酸緩沖液配)，二者均獲顯示，但作者仍認(rèn)為應(yīng)用PA-Gold電鏡雜交技術(shù)在K4M包埋切片上進(jìn)行載網(wǎng)雜交的顯示結(jié)果以及形態(tài)保存更為理想。
