三、應(yīng)用地高辛標(biāo)記rRNA探針的電鏡原位雜交技術(shù)
�。ㄒ�)基本原理
在地高辛標(biāo)記核酸探針廣泛用于光鏡水平的原位雜交試驗(yàn)并獲極為滿意的結(jié)果后，科學(xué)工作者試圖將其應(yīng)用于電鏡水平。其基本原理和生物素標(biāo)記核酸探針-PA-Gold電鏡雜交技術(shù)的基本原理相似，首先利用地高辛修飾核酸探針，與細(xì)胞或組織進(jìn)行雜交，再用抗地高辛抗血清相連膠體金與之結(jié)合，進(jìn)行細(xì)胞或組織特異核苷酸的超微結(jié)構(gòu)定位。為增強(qiáng)金的顯示效應(yīng)，可用銀加強(qiáng)法增強(qiáng)金粒的顯示效應(yīng)。
（二)基本操作方法（Fischer D et al, 1992)
1．組織處理
�。�1)固定：固定劑采用4%多聚甲醛（PFA，用PBS配制)加0.5%戊二醛（GA)，保存在4℃。作者采取浸入法，即取大鼠肝臟放入冷固定劑中（4%PFA，不含GA)，切成1mm3左右的小方塊。修整好的組織塊移入另一玻皿中，內(nèi)盛有4%PFA和0.5%GA,固定2h。
�。�2)PBS（4℃)漂洗3～5min。
（3)脫水
時間乙醇濃度溫度
2×15min 30% 4℃
30min 30% 4℃
30min 50% -20℃
2×30min 70%，90%，96%，100% -20℃
注意勿使酒精揮發(fā)致使組織干燥。
�。�4)浸透和包埋（Carlemalarm et al, 1989)：由于K4M包埋劑有揮發(fā)性，因此，此步操作者必須帶手套，在通風(fēng)柜中進(jìn)行，注意K4M包埋劑不要靠近O2，一切在低溫下進(jìn)行，最好設(shè)有恒低溫的冷柜。
�、貺owcryl K4M配方
1)交聯(lián)劑A 2g
2)單體B 13g
3)引發(fā)劑 0.075g
混合1)，2)后，再加“3)”輕攪勻，混勻后置于-20℃。
�、诮福╥nfiltration)，在-20℃進(jìn)行
時間液體
1h 100%乙醇：K4M（1：1，V/V)
2×1h K4M
過夜 K4M
2×3h K4M
�、郯瘢� 先將膠囊冷卻，滴入幾滴K4M，然后每個膠囊內(nèi)放入一個組織塊，以K4M充滿膠囊，在室溫放置30min，使包埋劑中氣泡逸出。然后置于0℃-40℃之間，利用紫外線燈360nm波長照射5天，溫度必須保存恒定。然后移至室溫使溫度回升，膠囊變硬。
�、芮衅河捎谀z囊是透明的，包埋在內(nèi)的肝組織很容易識別。修塊后進(jìn)行切片，由于K4M是親水性的，在切片過程中注意組織塊表面一定不要讓水浸濕，用200個網(wǎng)眼的鎳網(wǎng)覆以For－mvar膜和碳膜撈取切片，空氣干燥備用于雜交。
2．探針準(zhǔn)備rRNA探針以Dig-UTP標(biāo)記，注意探針不宜過長，否則影響對組織的穿透性。如過長，可事先用第二十章 介紹的探針?biāo)夥ㄌ幚怼?/P>
3．雜交本步驟均在濕盒內(nèi)進(jìn)行，將雜交液滴滴于蠟?zāi)ど�，將鎳網(wǎng)載有切片面覆于液滴上，在65℃雜交至少3h。雜交液含：5×SSC，0.1mg/ml tRNA,Dig-UTP反意探針10ng/μl(et 1×SSC配，含150mmol/L NaCl, 15mmol/L醋酸鈉)。
4．雜交后漂洗 在室溫用2×SSC漂洗3×5min，然后用PBST（PBS,0.1%Tween)漂洗2×10min。
5．顯示
�、僖訮BST加BT封閉（BT配方：PBST，1%BSA)孵育15min。
②應(yīng)用抗地高辛抗體結(jié)合直徑1mm的金粒，以PBST加BG稀釋為1：30，室溫孵育1h。
�、垡訮BST漂洗3×5min。
�、芤詭ЧP尖嘴軟塑料壺沖洗6×15min。
�、菀糟y增強(qiáng)法，在暗室中孵育于顯影液：促進(jìn)液（Enhancer)1：1,4～20min。
�、拗貜�(fù)④。
⑦以2%醋酸鈾（4min)，枸緣酸鉛1min染色，漂洗，空氣干燥。
�、嚯婄R觀察。
四、結(jié)語
原位分子雜交技術(shù)在電鏡水平的應(yīng)用，或簡稱為電鏡原位分子雜交技術(shù)是基因表達(dá)在超微結(jié)構(gòu)定位的一項(xiàng)極有前景的新興技術(shù)。但要使之完善，還需要做許多工作。必須說明的是電鏡原位雜交技術(shù)和光鏡原位雜交技術(shù)一樣必須設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)組，對顯示的結(jié)果的解釋應(yīng)持審慎的態(tài)度。一般應(yīng)在重復(fù)多次實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上才能得出對本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，不能只憑一次實(shí)驗(yàn)或一張電鏡照片就勿忙結(jié)論。因原位雜交技術(shù)是高度敏感、高度特異性技術(shù)，影響因素很多。電鏡原位雜交技術(shù)的影響和干擾因素更多。相信在不久的將來，隨著電鏡原位雜交技術(shù)的廣泛應(yīng)用，科技工作者將從實(shí)踐中對本技術(shù)的實(shí)驗(yàn)流程不斷完善并有更多的新的電鏡原位雜交技術(shù)方法涌現(xiàn)。
