| 公開(公告)號 | CN1793324A |
| 公開(公告)日 | 2006.06.28 |
| 申請(專利)號 | CN200510045207.1 |
| 申請日期 | 2005.11.25 |
| 專利名稱 | 利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)及糖基化改造人干擾素-β的方法 |
| 主分類號 | C12N1/19(2006.01)I |
| 分類號 | C12N1/19(2006.01)I;C12N15/22(2006.01)I;C12P21/02(2006.01)I;C12R1/84(2006.01)N |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 山東大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 陳 敏;王慶杰;王 鵬 |
| 地址 | 250100山東省濟南市歷城區(qū)山大南路27號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | 濟南金迪知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 |
| 代理人 | 鮑光明 |
| 國省代碼 | 山東;37 |
| 主權(quán)項 | 一種利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)及糖基化改造人干擾素-β的方法，由下述步驟組成 (1)重組表達(dá)載體的構(gòu)建： 克隆出人IFNβ基因，通過PCR方法將IFNβ基因起始密碼子ATG前增加KR＝AAAAGA序列，以提高Kex2蛋白酶的酶切作用，避免畢赤酵母分泌表達(dá)外源基因時存在信號肽切割不完全，使重組蛋白N端帶有信號肽氨基酸序列的情況；同時末端Arg的堿基CGA設(shè)計為畢赤酵母喜好密碼子AGA，以提高IFNβ在畢赤酵母中的表達(dá)；完成分子水平基因改造后將基因構(gòu)建到酵母表達(dá)載體中，得重組表達(dá)載體； (2)重組酵母菌株的構(gòu)建： 用SalI將重組載體pPIC9kIFNβ線性化；電轉(zhuǎn)到酵母菌株基因組中，構(gòu)建重組酵母菌株；在MD平板上長出的菌落為陽性克隆；其中，MD平板培養(yǎng)基配方為：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖；通過G418抗生素篩選出高拷貝的陽性菌株； (3)人干擾素-β蛋白在酵母中誘導(dǎo)表達(dá)： 將上述陽性菌株，接種于YPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12-24小時，搖床轉(zhuǎn)速為240-270轉(zhuǎn)/分；當(dāng)發(fā)酵液濃度達(dá)OD＝5-6時，按體積比1∶100的接種量轉(zhuǎn)接到BMG培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速為240-270轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)28～35小時；5000g離心5～10分鐘，收集菌體，用PBS洗滌菌體1～2次，轉(zhuǎn)接到BMM液體培養(yǎng)基中，使發(fā)酵液濃度達(dá)OD＝0.5-1.0時，誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)溫度20℃-30℃，搖床轉(zhuǎn)速為180-250轉(zhuǎn)/分，每隔12小時向培養(yǎng)基中加入5～10ml/L量的甲醇，培養(yǎng)24-96小時； 其中PBS為：pH6.0，100mM磷酸鹽緩沖液； 其中YPD培養(yǎng)基配方為：10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖； 其中BMG培養(yǎng)基配方為：pH6.0，100mM磷酸鹽緩沖液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L； 其中BMM液體培養(yǎng)基配方為：pH6.0，100mM磷酸鹽緩沖液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L； 其中，上述重組陽性克隆工程菌株可以通過離心、過濾去除； (4)重組蛋白提取及純化 選用藍(lán)譜直接將酵母菌株的上清液進行重組蛋白的純化； (5)對重組蛋白進行表面糖鏈的改造 選用外切糖苷酶對所得重組蛋白進行糖基化改造；在一定的酶反應(yīng)條件下切除重組干擾素β蛋白的糖鏈部分。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)及糖基化改造人干擾素-β的方法。本發(fā)明應(yīng)用重組DNA技術(shù)在甲醇酵母細(xì)胞如巴斯德畢赤酵母細(xì)胞中生產(chǎn)基因重組人干擾素β并進行糖基化改造的方法，獲得既具有真核生物的蛋白翻譯后修飾和加工，又不具有抗原性的干擾素β蛋白。本發(fā)明還涉及適合甲醇酵母表達(dá)的人干擾素β改構(gòu)基因的設(shè)計；表達(dá)載體的構(gòu)建；基因組中至少穩(wěn)定地整合有一個拷貝改構(gòu)干擾素β基因的甲醇酵母工程菌；工程菌的基因表達(dá)；糖基化改造等方面。本發(fā)明方法可實現(xiàn)干擾素β高效表達(dá)及糖鏈改造，且分離工藝簡便。所產(chǎn)生的干擾素β不具有酵母蛋白的N-糖基化，若作為蛋白藥物不會在人體內(nèi)產(chǎn)生免疫源性；也不會因為過糖基化使表達(dá)蛋白失去活性。 |
| 國際公布 |
