| 公開(kāi)(公告)號(hào) | CN1256430C |
| 公開(kāi)(公告)日 | 2006.05.17 |
| 申請(qǐng)(專(zhuān)利)號(hào) | CN200410025405.7 |
| 申請(qǐng)日期 | 2004.06.17 |
| 專(zhuān)利名稱(chēng) | 家蠶作為“生物工廠”生產(chǎn)重組人VEGF的方法 |
| 主分類(lèi)號(hào) | C12N15/12(2006.01)I |
| 分類(lèi)號(hào) | C12N15/12(2006.01)I;C12N15/10(2006.01)I;C12N15/866(2006.01)I;C12N5/10(2006.01)I |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人 | 浙江大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 吳小鋒;姚慧鵬;曹翠平 |
| 地址 | 310027浙江省杭州市西湖區(qū)浙大路38號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專(zhuān)利代理機(jī)構(gòu) | 杭州求是專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 |
| 代理人 | 林懷禹 |
| 國(guó)省代碼 | 浙江;33 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種家蠶作為“生物工廠”生產(chǎn)重組人VEGF的方法，其特征在于： (1)含有人VEGF基因的重組桿狀病毒的構(gòu)建：將VEGF基因克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlueBacHis獲得重組體pBlueBacHis-VEGF；通過(guò)共轉(zhuǎn)染在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)與雜交桿狀病毒HyNPVDNA同源重組產(chǎn)生重組病毒，然后在聚苯乙烯錐形管中加入1μgpBlueBacHis-VEGFDNA和15μgHyNPVDNA，混勻，并加入14μl脂質(zhì)體lipofectin，最后加入滅菌蒸餾水至終體積40μl；將該混合物在室溫培育15分鐘后共轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf21培養(yǎng)細(xì)胞；用無(wú)血清的TC-100培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后，換成含有10％胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)基上清作為病毒儲(chǔ)存原液，用來(lái)篩選重組病毒，重組病毒通過(guò)幾輪空斑篩選，最終獲得高濃度純化的病毒溶液，濃度為108pfu/ml，申請(qǐng)人將此重組病毒命名為HyNPV-VEGF； (2)家蠶體內(nèi)表達(dá)和重組VEGF純化：使用家蠶幼蟲(chóng)5齡起蠶，接種上述重組病毒進(jìn)行感染表達(dá)；接種前，將幼蟲(chóng)浸在冰水浴中麻醉10分鐘，注射用病毒懸浮液濃度為106pfu/ml，采用皮下注射的方法，每條家蠶注射20μl，注射1小時(shí)后給桑，在23-25℃下飼養(yǎng)；感染后的三天內(nèi)，看不到明顯的癥狀，到第四天，幼蟲(chóng)開(kāi)始食欲減弱，漸漸地呈現(xiàn)出感染癥狀；感染后地五天或第六天，感染的幼蟲(chóng)大部分死亡，在此之前收集家蠶幼蟲(chóng)； 將幼蟲(chóng)的血淋巴作為重組人VEGF純化的起始材料，使用以下方法收集血淋巴：在15ml收集管的上方，將幼蟲(chóng)向背面彎曲，用一只手固定幼蟲(chóng)的頭部和尾部，讓腹部和腹足伸向外邊；用石蠟?zāi)っ芊獾?5號(hào)針頭刺破腹足收集血液，讓血液直接滴進(jìn)收集管中，為了防止血液氧化變黑，預(yù)先加入1/10體積的10mmol/L二硫蘇糖醇DTT，使其終濃度為1mmol/L； 由于重組蛋白N-末端帶有6×His尾巴，可以用Ni-NTA親和柱在非變性條件下進(jìn)行蛋白純化；從感染的幼蟲(chóng)收集的血淋巴用非變性結(jié)合緩沖液，Na3PO450mmol/L，NaCl0.5mol/L，pH8.0，進(jìn)行稀釋?zhuān)粯悠冯S后結(jié)合于Ni-NTA柱，最后，重組蛋白用含有250mmol/L咪唑的非變性洗脫緩沖液洗脫，通過(guò)SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色后鑒定重組蛋白； (3)重組VEGF活性分析鑒定：用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC分析重組人VEGF的生物活性；細(xì)胞在含有Earle’s鹽的培養(yǎng)基199中37℃培養(yǎng)，補(bǔ)充5％的CO2，培養(yǎng)基中另外添加100units/ml青霉素，100units/ml鏈霉素，4.0mg/ml兩性霉素B，20％熱滅活補(bǔ)加牛血清，5units/ml肝素和50mg/ml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物質(zhì)ECGS；細(xì)胞用胰蛋白酶消化后接種于24孔組織培養(yǎng)板，細(xì)胞密度大約為1.0×104cells/well，每孔加1ml同樣的培養(yǎng)基，24小時(shí)后，將培養(yǎng)基更換為含有10％SCS和5units/ml肝素，但是不含有ECGS的新鮮培養(yǎng)基199；純化的重組VEGF經(jīng)梯度稀釋后用0.22μm滅菌過(guò)濾器過(guò)濾滅菌，加入到培養(yǎng)板孔中，每孔體積不超過(guò)10μl；72小時(shí)后，用PBS洗兩次，用胰蛋白酶消化后離心收集細(xì)胞，重懸于200μlPBS中，0.4％臺(tái)酚藍(lán)染色后，用血球計(jì)計(jì)算細(xì)胞個(gè)數(shù)；結(jié)果表明，重組VEGF能夠刺激HUVEC增殖，這表明家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)的VEGF具有生物學(xué)活性。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開(kāi)了一種家蠶作為“生物工廠”生產(chǎn)重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF的方法。利用構(gòu)建的AcNPV和BmNPV的雜交桿狀病毒HyNPV作為載體，構(gòu)建了重組含有人VEGF基因的重組病毒。利用家蠶作為重組桿狀病毒的宿主，高水平表達(dá)了具有很高生物活性的重組人VEGF。解決了VEGF在大腸桿菌中表達(dá)需要復(fù)雜的復(fù)性操作、酵母表達(dá)中質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體不穩(wěn)定和在哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)的成本太高的缺點(diǎn)，家蠶幼蟲(chóng)表達(dá)的重組人VEGF大部分被分泌進(jìn)血淋巴中，非常有利于蛋白質(zhì)的快速提取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明利用重組桿狀病毒以家蠶作為“生物工廠”生產(chǎn)重組人VEGF安全、實(shí)用、可行。重組VEGF可以大量生產(chǎn)為VEGF在醫(yī)學(xué)和治療領(lǐng)域上的應(yīng)用開(kāi)辟了廣闊的前景。 |
| 國(guó)際公布 |
