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中國生物制品規(guī)程:附錄2 百日咳菌苗原液免疫力試驗方法

1 免疫1.1 動物選用體重10~12g同性或雌雄性各半的健康NIH小白鼠。將動物隨機分為三組,每組16只或20只(同性或雌雄性各半,為保證攻擊后有16只或20只小白鼠,可適當多免疫幾只小白鼠),同時飼養(yǎng)健康小白鼠55只,備做對照用。1.2 免疫原稀釋將百日咳原液用生理鹽水或…

1 免疫

1.1 動物

選用體重10~12g同性或雌雄性各半的健康NIH小白鼠。

將動物隨機分為三組,每組16只或20只(同性或雌雄性各半,為保證攻擊后有16只或20只小白鼠,可適當多免疫幾只小白鼠),同時飼養(yǎng)健康小白鼠55只,備做對照用。

1.2 免疫原稀釋

百日咳原液用生理鹽水或pH7.3±0.1磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋至成品菌苗濃度的1/2,然后再稀釋7.5×、37.5×、www.med126.com187.5×,百日咳參考菌苗稀釋至每ml含8IU,然后再稀釋成每ml含1.0IU(0.125ml)、0.2IU(0.025ml)及0.04IU(0.005ml)。

1.3 免疫方法

將不同稀釋度的免疫原分別免疫小白鼠,每只小白鼠各腹腔注射0.5ml。

2 攻擊菌及攻擊菌液的制備

2.1 菌種

小白鼠腦內(nèi)攻擊用58030(18323)菌株。

2.2 培養(yǎng)基

可用包-氏培養(yǎng)基(含羊血20%~30%)或其他適宜的培養(yǎng)基。

2.3 培養(yǎng)溫度及時間

放35~37℃培育,第一代不超過72小時,攻擊時菌種的培育時間為20~24小時。原代菌種放2~8℃可保存2周。

2.4攻擊菌液的制備

將培育20~24小時的菌苔經(jīng)肉眼檢查為純菌后,刮入生理鹽水或pH7.3±0.1緩沖生理鹽水,用滅菌脫脂棉過濾,測定濃度,然后用pH7.0~7.2水解酷素、蛋白胨水或肉湯稀釋成每0.03ml含菌8萬,作為試驗組的攻擊菌液,然后再連續(xù)稀釋,使每0.03ml分別含8000、800、80及8個菌,以上5個不同稀釋度的菌液,作為對照組的攻擊m.52667788.cn/zhuyuan/菌液。

2.5 工作起止時間

自攻擊菌液制備(開始刮菌)至注射完最后1只小白鼠不得超過2.5小時。

2.6活菌計數(shù)

在攻擊前后,可將0.03ml含8個菌的攻擊菌液,接種于包一姜氏培養(yǎng)基或其他適宜的培養(yǎng)基平皿中,每個平皿0.2ml,每次不得少于2個平皿,其菌落形成單位約為濁度測定的1/4。

3 攻擊

動物免疫后14天,每只小白鼠腦內(nèi)攻擊0.03ml菌液(含8萬個菌),用0.25ml注射器,4號針頭。在試驗組攻擊后再進行對照組毒力測定,對照組每稀釋度攻擊10只小白鼠。

4 記錄結(jié)果

動物攻擊后觀察14天。攻擊后第2天,將試驗組動物處理成每組16只或20只。以后逐日觀察動物并記錄死亡數(shù),最初3天死亡的動物不作統(tǒng)計,至第14天有麻痹、頭部腫脹、弓背及明顯聳毛的動物按死亡計算。

5 結(jié)果計算

5.1 按Wilson-Worcester氏法計算參考菌苗及待檢菌苗的ED50±SD%,每個ED50標準差的范圍一般應(yīng)為64%~156%。

5.2 按Reed-Muench氏法計算對照組LD50,1個LD50的菌數(shù)應(yīng)不高于800個菌。

5.3 計算均質(zhì)性因子“α”。

5.4IU計算

待檢原液每ml應(yīng)含IU=參考菌苗ED50/待檢原液ED50×參考菌苗每ml的IU數(shù)

6 效力評價

百日咳原液按成品菌苗嘗試稀釋后,每個接種劑量的免疫效價應(yīng)不少于4.0IU。

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