動(dòng)脈粥樣硬化:第一節(jié)　血清載脂蛋白定量的方法學(xué)及其參考值的評(píng)價(jià)

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一、載脂蛋白測(cè)定方法1．單向免疫擴(kuò)散法（radialimmunodiffusion,RID）該法較簡(jiǎn)單，一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行。消耗較多的抗血清，擴(kuò)散過(guò)程至少24h，最多需72h，測(cè)定下限值為10μg/ml。該方法雖然簡(jiǎn)單，應(yīng)嚴(yán)格控制有關(guān)條件如：含抗血清的瓊脂糖凝膠厚度要均勻；加入小孔的稀釋…

一、載脂蛋白測(cè)定方法

1．單向免疫擴(kuò)散法（radialimmunodiffusion,RID)

該法較簡(jiǎn)單，一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行。消耗較多的抗血清，擴(kuò)散過(guò)程至少24h，最多需72h，測(cè)定下限值為10μg/ml。該方法雖然簡(jiǎn)單，應(yīng)嚴(yán)格控制有關(guān)條件如：含抗血清的瓊脂糖凝膠厚度要均勻；加入小孔的稀釋抗原（血清)量要準(zhǔn)確；含ApoB的脂蛋白如VLDL和LDL顆粒大小不一，如瓊脂糖凝膠濃度在1.5%～2.0%,可能僅測(cè)出LDL的ApoB，大顆粒的LDL及VLDL的ApoB可能無(wú)法測(cè)出，因?yàn)殡y以穿過(guò)瓊脂糖凝膠的孔隙。另外，擴(kuò)散過(guò)程中，凝膠板一定要水平，否則易使擴(kuò)散環(huán)呈橢圓形，難以準(zhǔn)確測(cè)量直徑。一般使沉淀環(huán)以3.5～10.0mm為宜，應(yīng)在兩個(gè)方向測(cè)量直徑，其精度要求達(dá)到0.1mm。采用五種不同濃度參考值，測(cè)定沉淀環(huán)面積對(duì)相應(yīng)濃度關(guān)系以曲線回歸方程作圖。

2．電免疫測(cè)定法（electroimmunoassay,EIA)

該法靈敏，抗血清用量少，如瓊脂糖緩沖液中加入聚乙二醇及甘氨酸，其電泳時(shí)間可縮短一倍，火箭峰高以1～4cm為宜，火箭峰的測(cè)量可以計(jì)算面積或峰高，峰高從中心量起。測(cè)量精度最好能在0.1mm,靈敏度約2μg/ml，又稱為火箭電泳法。

3．免疫比濁法(immunoturbidimetryassay,ITA)

簡(jiǎn)便快速，在自動(dòng)分析儀進(jìn)行操作并能批量檢測(cè)，是目前臨床使用最多的方法學(xué)。免疫比濁法有兩種：一是測(cè)定光散射的，又名免疫散射比濁法（INA)；需用特殊的激光濁度儀；另一種是利用光度計(jì)測(cè)定通過(guò)混濁溶液后的透光強(qiáng)度，稱為透射免疫比濁法（ITA)，其靈敏度低于INA。比濁法可以終點(diǎn)法和速率法測(cè)定，速率法是根據(jù)散射光強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系，以微機(jī)處理計(jì)算出抗原抗體復(fù)合物形成的最大反應(yīng)速度，后者與溶液中抗原量成正比，常可在1min內(nèi)完成測(cè)定過(guò)程，可自動(dòng)扣除空白；終點(diǎn)法比速率法穩(wěn)定，一般多用終點(diǎn)法。

4．酶聯(lián)免疫法（enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)

該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于極微量蛋白的定量測(cè)定，可測(cè)出ng級(jí)水平的抗原或抗體含量，該法可用于ApoE、C-Ⅱ、C-Ⅲ等含量較少的載脂蛋白的定量測(cè)定。

5．放射免疫法（radioimmunoassay,RIA)

該法靈敏，抗血清用量少，所需設(shè)備較多，一般用¹²⁵I標(biāo)記抗原作為示蹤物，除ApoC-Ⅰ（不含酪氨酸)以外，都可以作碘標(biāo)記（氯胺T法)，以雙抗體法測(cè)定RIA法可檢測(cè)最低至3～5ng。臨床檢驗(yàn)中不常用此法，主要用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的科學(xué)研究工作。

還有熒光免疫法和化學(xué)發(fā)光法等靈敏度很高的方法。

血清載脂蛋白測(cè)定的方法，從測(cè)定原理、方法學(xué)評(píng)價(jià)及參考值，劉秉文和李健齋等人作了大量的工作，為國(guó)內(nèi)的載脂蛋白測(cè)定的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。周新曾于1986年首先在國(guó)內(nèi)研制成功抗人ApoB₁₀₀血清，其后，國(guó)內(nèi)同仁陸續(xù)研制出ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、E、CⅡ、CⅢ抗血清，并廣泛應(yīng)用于臨床的疾病診斷，在部分大醫(yī)院已成為常規(guī)檢查項(xiàng)目。

劉秉文在“脂蛋白與動(dòng)脈粥樣硬化“一書中全面總結(jié)了國(guó)內(nèi)外載脂蛋白測(cè)定的方法學(xué)及其參考值，本節(jié)將引用如下比較表：

表18-1　ApoAⅠ免疫測(cè)定法的比較

	RIA	ELISA	EIA	RID	INA	ITA
抗體	P，M	P，M	P	P，M	P	P
靈敏度（n)	0.3～10	0.1～0.5	100	100	150	100
測(cè)定范圍（ng)	1～200	0.5～15	100～500	200～800	200～500	200～600
批內(nèi)CV（%)	3～9	4～8	3～5	6	3～7	1
批間CV（%)	5～10	8～10	3～9	10	6～7	6
正常值（g/L)	1.0±0.2	1.5±0.2	1.2±0.2	1.2±0.1	1.2±0.2	1.7±0.2

P:多克隆抗體；M：?jiǎn)慰寺】贵w；RIA：放射免疫法；ELISA；酶聯(lián)免疫法；RID：?jiǎn)蜗蛎庖邤U(kuò)散法；INA：免疫散射比濁法；ITA：免疫透射比濁法。

（源自：劉秉文，1995.)

表18-2 ApoAⅡ免疫測(cè)定法的比較

	RIA	ELISA	EIA	RID	INA	ITA
抗體	P	P，M	P	P	P	P
靈敏度（g)	0.5		20	m.52667788.cn/yishi/5	30	20
測(cè)定范圍（ng)	1～20	5～50	30～60	50～400	50～900	40～150
批內(nèi)CV（%)	7	8	5	5	5	5
批間CV（%)	9	7	8	-	7	6
正常值（g/L)	0.25±0.4	0.35±0.05	0.76±0.2	0.29±0.02	0.37±0.09	0.36±0.03

（源自：劉秉文，1995.)

表18-3 ApoAⅣ免疫測(cè)定法的比較

	RIA	ELISA	EIA
抗體	P	P	P
靈敏度（g)	5	0.2	20
測(cè)定范圍（ng)	5～50	0.5～8	50～200
批內(nèi)CV（%)	5	3.60	5
批間CV（%)	7	8	9
正常值（g/L)	0.17±0.03	0.14±0.05	0.14±0.04

（源自：劉秉文，1995.)

表18-4 ApoB₁₀₀免疫測(cè)定法的比較

	RIA	ELISA	EIA	RID	INA	ITA
抗體	P，M	P，M	P	P，M	P	P
靈敏度（n)	5～10	2～20	50～300	300	300	300
測(cè)定范圍（ng)	0～100	2～10	20～500	50～600	300～500	100～500
批內(nèi)CV（%)	4～8	4～7	1～7	3～7	4～7	2
批間CV（%)	7～11	10	3～10	6～7	7～8	2
正常值（g/L)	0.9±0.2	0.85±0.1	0.6±0.3	0.8±0.2	0.8±0.2	0.8±0.3

（源自：劉秉文，1995.)

表18-5 ApoCⅠ免疫測(cè)定法的比較

	RIA	ELISA	INA
抗體	P	P	P
靈敏度（n)	1	5	50
測(cè)定范圍（ng)	5～30	15～100	-
批內(nèi)CV（%)	7	3	5
批間CV（%)	9	5	8
正常值（g/L)	0.05±0.03	0.06±0.002	0.06±0.01

（源自：劉秉文，1995.)

表18-6 ApoCⅡ免疫測(cè)定法的比較

	RIA	ELISA	EIA	RID	ITA
抗體	P	P	P	P	P
靈敏度（g)	10	0.3	45	40	10
測(cè)定范圍（ng)	10～80	0.5～5	70～600	40～600	12～50
批內(nèi)CV（%)	6	3	6.5	2.1	3.3
批間CV（%)	10	8	8.2	3.9	6.2
正常值（g/L)	0.04±0.01	0.033±0.008	0.04±0.002	0.039±0.017	0.04±0.01

（源自：劉秉文，1995.)

表18-7 ApoCⅢ免疫測(cè)定法的比較

	RIA	ELISA	EIA	RID	INA	ITA
抗體	P	P	P	P	P	P
靈敏度（g)	1	0.3	10	76	20	15
測(cè)定范圍（ng)	2～20	1～6	20～80	76～600	50～400	30～120
批內(nèi)CV（%)	13	4.3	8	2.5	6.3	5.2
批間CV（%)	13	4.3	8	3.5	6.3	5.2
正常值（g/L)	0.15±0.06	0.16±0.03	0.12±0.04	0.127±0.037	0.12±0.03	0.11±0.03

（源自：劉秉文，1995.)

二、人血漿（清)載脂蛋白參考值比較

劉秉文于1995年對(duì)國(guó)人血漿（清)各項(xiàng)載脂蛋白參考值與國(guó)外參考值作了詳細(xì)的比較，其報(bào)道見表18-9、18-10、18-11、18-12、18-13、18-14、18-15。

表18-8 ApoE免疫測(cè)定法的比較

	RIA	ELISA	EIA	RID	ITA
抗體	P	P，M	P	P	P
靈敏度（n)	0.2～8	0.5	20	35	5
測(cè)定范圍（ng)	0.8～100	0.5～6	20～200	50～300	20～400
批內(nèi)CV（%)	6	4	8	5.9	2
批間CV（%)	9	8	5	7.2	5
正常值（g/L)	0.05±0.02	0.04±0.01	0.10±0.04	0.035±0.01	0.04±0.01

（源自：劉秉文，1995.)

表18-9 國(guó)人血漿ApoAⅠ含量與國(guó)外報(bào)道的比較

作者	發(fā)表時(shí)間	方法	例數(shù)	性別	年齡	均值±s（mg/dl)
張祖輝	1998	RID	307	男	20-77	122.1±13.7
劉秉文			318	女	20-77	125.5±15.9
李鍵齋等	1986	EIA	291	男+女	19-50	119±17
周新等*	1990	EIA	692	男	13-85	129.1±16.1
	477	女	18-80	130.5±14.2
Albers等	1976	RID	20	男+女	11.5±7.3	115.7±7.3
Cheung等	1977	RID	172	男	20-65	120±20
188	女	20-65	135±25
Reman等	1978	RID	95	男	40-49	137±23
104	女	40-49	137±23
Schonfelcl等	1974	RIA	41	男	13-58	100±35
34	女	16-58	104±34
Karlin等	1976		23	男	20-39	130±3
19	女	20-39	154±6
Avogaro等	1978	EIA	60	男	20-60	128±22
60	女	20-60	134±20
Mordasini等	1980	EIA	50	男	20-60	113±9
50	女	20-60	125±17
Miller等	1980	EIA	8	男	34-70	122±27
8	女	52-68	149±20
Rosseneu等	1981	IAN	12	男	29	139±15
14	女	30	147±24
Assmann等	1982	INA	3032	男	20-65	136±23
1367	女	20-60	146±25

（源自：劉秉文，1995)

*：作者補(bǔ)充。

表18-10 國(guó)人血漿ApoAⅡ含量與國(guó)外報(bào)道的比較

作者	發(fā)表時(shí)間	方法	例數(shù)	性別	均值±s（mg/dl)
羅靜聰	1988	RID	76	男+女	26.7±4.6
劉秉文	1988	ELISA	41	男+女	24.2±5.9
胡維誠(chéng)	1987	RID	160	男+女	27.0±4.4
Curry等	1976	RID	19	男	78.0±1.7
			19	女	83.0±25
Cheung等	1977	RID	172	男	33.0±5
			188	女	36.0±6
Assmann等	1977	EIA	15	男	34.1±5
			15	女	38.3±5.5
Schonfeld等	1977	RLA	29	男+女	40.5±8.9
Maupovic等	1981	ELA	50	男+女	68.0±18
Goldberg等	1980	RIA	50	男	25.0±1
			50	女	26.0±1
De Backnev等	1982	INA	70	男+女	43.0±6.9
Zech等	1983	RID	27	男+女	24.0±0.6
Noma等	1983	RLA	27	男+女	32.0±8.3
Nukita等	1984	EIA	156	男+女	40.0±9

（源自：劉秉文，1995)

表18-11 國(guó)人血漿ApoB含量與國(guó)外報(bào)道的比較

作　者	發(fā)表時(shí)間	方法	例數(shù)	性別	均值±s（mg/dl)
周新等	1986	EIA	608	男	83.2±13.9
			511	女	80.4±13.4
李健齋等	1986	EIA	727	男+女	76±19
吳兆豐、劉秉文	1987	RID	304	男	87.9±14.4
			320	女	86.7±14.4
Albers等	1975	RIA	349	男+女	81.0±20
Bantorich等	1975	RIA	82	男+女	90.0±24
Bedford等	1976	RIA	128	男+女	87.0±30
Schonfeld等	1974	RIA	42	男+女	83.0±16
Brussaard等	1980	EIA	60	男+女	63±16
Fruchart等	1981	EIA	144	男+女	90
Curry等	1978	EIA	38	男	90±2.0
			36	女	88±11
Curry等	1978	RID	20	男+女	87±26
Lees等	1970	RID	64	男+女	83±25
Snuderman等	1975	RID	31	男	82±22
Fievet等	1979	INA	206	男	129±31
			271	女	120±34
Heuck等	1979	INA	68	男+女	82.0±23
Rossenue等	1981	INA	70	男	92±13
Durrington等	1976	INA	29	男+女	85±11

（源自：劉秉文，1995)

表18-12 國(guó)人血漿ApoCⅠ含量與國(guó)外報(bào)道的比較

作　者	發(fā)表時(shí)間	方法	例數(shù)	性別	均值±s（mg/dl)
傅明德等	1987	ELISA	202	男	7.6±2.5
			214	女	8.0±2.3
Polz等	1980	RID	10	男+女	6.9±2.0
Curry等	1981	ELA	68	男+女	6.0±1.5

（源自：劉秉文，1995)

表18-13 國(guó)人血漿ApoCⅡ含量與國(guó)外報(bào)道的比較

作　者	發(fā)表時(shí)間	方法	例數(shù)	性別	均值±s（mg/dl)
傅明德等	1987	ELISA	202	男	5.2±1.9
			241	女	4.9±1.8
范萍等	1989	RID	67	男+女	3.9±1.7
Schonfeld等	1979	RIA	93	男+女	3.9±1.4
Curry等	1981	EIA	68	男+女	4.0±2.0
Kashyap等	1977	RIA	32	男+女	5.0±0.4

（源自：劉秉文，1995)

表18-14 國(guó)人血清ApoCⅢ含量與國(guó)外報(bào)道的比較

作者	發(fā)表時(shí)間	方法	例數(shù)	性別	均值±s（mg/dl)
傅明德等	1988	ELISA	134	男	11.6±3.6
			135	女	12.0±3.7
范萍等	1989	RID	67	男+女	12.7±3.7
劉秉文等	1987	IRA	21	男+女	9.2±2.1
Schonfeld等	1979	RID	93	男+女	15.4±6.2
Curry等	1980	ELA	54	男+女	10.9±3.0
Kashyap等	1981	RIA	29	男+女	11.1±0.9

（源自：劉秉文，1995)

表18-15 國(guó)人血漿ApoE含量與國(guó)外報(bào)道的比較

作者	發(fā)表時(shí)間	方法	例數(shù)	性別	均值±s（mg/dl)
劉銘鋒、劉秉文等	1987	ELISA	42	男+女	3.57±1.24
劉銘鋒、劉秉文等	1987	ELA	50	男+女	4.70±1.18
劉銘鋒、劉秉文等	1992	RID	116	男	3.95±0.98
			122	女	4.00±1.32
張東升、夏輝明	1991	ELISA	25	男+女	3.45±1.24
Blum等	1980	RIA	26	男+女	3.6±1.3
Gregg等	1984	RIA	12	男+女	4.8±1.2
Wesgraber等	1984	RIA		男+女	5(3.5-7.0)

（源自：劉秉文，1995)

王抒、李健齋等于1996年報(bào)道283例血清各項(xiàng)載脂蛋白測(cè)定值及百分位數(shù)，如表18-16、18-17、18-18所示。這批數(shù)據(jù)是目前國(guó)內(nèi)采用同一份標(biāo)本檢測(cè)脂質(zhì)、脂蛋白和載脂蛋白項(xiàng)目最多的1次報(bào)道。除了作為參考值供臨床應(yīng)用外，并闡明了各項(xiàng)指標(biāo)之間的相關(guān)性。筆者予以抄錄，供參考。

表18-16 血脂與脂蛋白水平（mmol/L)

項(xiàng)目	男（225例)	女（58例)	P值
TC	4.87±0.73	5.16±0.84	＜0.05
TG	1.27±0.66	1.25±0.71	＞0.05
HDL-C	1.41±0.35	1.54±0.36	＜0.02
HDL₂-C	0.56±0.17	0.63±0.19	＜0.02
HDL₃-C	0.86±0.23	0.91±0.19	＞0.05
LDL-C	2.95±0.68	3.13±0.12	＞0.05

（源自:王抒，1996)

表18-17 幾項(xiàng)常用比值^*

項(xiàng)　目	男	女
LDL-C/HDL-C	2.21±0.72	2.16±0.80
HDL₂-C/HDL₃-C	0.66±0.12	0.69±0.15
ApoB/ApoAⅠ	0.72±0.16	0.74±0.17
ApoAⅠ/ApoAⅡ	4.10±0.65	4.10±0．68
ApocⅡ/ ApoCⅢ	0.39±0.12	0.41±0.16

男女組間無(wú)顯著意義

（源自：王抒，1996)

表18-18 各項(xiàng)載脂蛋白測(cè)定值與百分位數(shù)

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項(xiàng)目	X±S	p5	p25	p50	p75	p95
男（225例)
ApoAⅠ(g/L)	1.42±0.17	1.17	1.30	1.43	1.51	1.72
ApoAⅡ(g/L)	0.36±0.66	0.28	0.32	0.35	0.40	0.46
ApoB(g/L)	1.01±0.21	0.72	0.86	1.00	1.14	1.38
ApoCⅠ(mg/L)	53±17	31	43	50	60	83
ApoCⅡ(mg/L)	34±16	13	24	31	42	69
ApoCⅢ(mg/L)	44±17	26	34	41	51	74
ApoE(mg/L)	44±17	26	34	41	51	74
Lp(α)(mg/L)	144125	26	53	107	185	382
女（58例)
ApoAⅠ(g/L)	1.45±0.14	1.21	1.34	1.44	1.55	1.74
ApoAⅡ(g/L)	0.36±0.06	0.26	0.33	0.36	0.39	0.44
ApoB(g/L)	1.07±0.23	0.71	0.90	1.08	1.20	1.49
ApoC(mg/L)	53±18	30	39	51	61	92
ApoCⅡ(mg/L)	41±18	20	28	38	49	77
ApoCⅢ(mg/L)	104±40	52	72	100	129	184
ApoE(mg/L)	51±18	33	37	48	58	89
Lp(α)(mg/L)	154±116	35	66	117	207	464

國(guó)內(nèi)的已有報(bào)道表明，人血清載脂蛋白參考值水平尚有一定的差異。引起這種差異的原因是多方面的，目前認(rèn)為主要原因有：①檢測(cè)方法與儀器不同；②試劑質(zhì)量尤其是抗血清技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一；③國(guó)內(nèi)尚未采用完全符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的定值血清；④人群的生活習(xí)慣及種族差異。為此對(duì)于國(guó)人的血清載脂蛋白參考值的確立，尚需付出艱辛的勞動(dòng)。

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