人胃螺旋菌(Gastrospirillum hominis,GH)是近來人們認(rèn)識(shí)到的除幽門螺桿菌（Helicobacter pylori, Hp)外的另一類與人胃炎有關(guān)的微生物，國(guó)內(nèi)報(bào)道人群感染率明顯高于國(guó)外。由于目前國(guó)內(nèi)外對(duì)GH尚未分離培養(yǎng)成功，對(duì)Gh的研究?jī)H限于組織學(xué)及形態(tài)學(xué)觀察，影響了對(duì)Gh本身及其致病性方面的深入認(rèn)識(shí)。我們自一接受胃鏡檢查的病人中，觀察到有Gh和Hp混合感染存在，并最終純化分離到了Gh和Hp。在對(duì)Gh的傳代培養(yǎng)中，我們較系統(tǒng)地觀察了不同培養(yǎng)條件及冷凍保存對(duì)其形態(tài)等的影響。現(xiàn)簡(jiǎn)要報(bào)告如下。
1 材料和方法
1.1 標(biāo)本來源
實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來源于一位在首都醫(yī)學(xué)院附屬天壇醫(yī)院接受胃鏡檢查的50歲的男性病人，病理學(xué)檢查證實(shí)其胃粘膜是中度慢性淺表性胃炎伴中度活動(dòng)性胃炎表現(xiàn)。胃鏡檢查時(shí)在胃竇部鉗取胃粘膜組織2塊，置于含10%小牛血清的布氏肉湯中，放于4°C保存4d后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。
1.2 胃粘膜組織尿素酶試驗(yàn)
參考Christensen尿素肉湯培養(yǎng)和Morris等快速診斷法，采用2%液體尿素常規(guī)法，于4h及24h觀察結(jié)果。
1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)及純化
在滅菌研磨器中將胃粘膜組織研磨成勻漿，涂于含6%脫纖維綿羊血的布氏瓊脂平板（含TMP5mg/L，萬古霉素6mg/L及多粘菌素B4mg/L)中，將平板置于含10%CO22、5%O2及85%N2的混合氣體培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)3d后涂片，在光鏡下觀察培養(yǎng)結(jié)果。在含10%脫纖維綿羊血的布氏瓊脂平板中進(jìn)行Gh菌單菌落純分離，并測(cè)定其尿素酶、氧化酶及過氧化氫酶活性。
1.4 不同培養(yǎng)條件下Gh生長(zhǎng)情況
�、賹⒓兓腉h菌分別接種于含6%與10%脫纖維綿羊血的布氏瓊脂平板中，置混合氣體環(huán)境，37°C培養(yǎng)3d，涂片檢查細(xì)菌形態(tài)。②將純化的Gh菌接種于含6%脫纖維綿羊血的布氏瓊脂平板中，局部分別滴加滅菌的布氏肉湯、新鮮脫纖維綿羊血及凍融脫纖維綿羊血，并分別加蓋一片滅菌的蓋玻片，使覆蓋部位呈厭氧狀態(tài)。放37°C培養(yǎng)3d，觀察細(xì)菌菌落生長(zhǎng)情況及涂片觀察細(xì)菌形態(tài)。③將純化的Gh菌接種于含10%小牛血清的布氏肉湯小管中（管口加滅菌綿塞)，放混合氣體環(huán)境，37°C培養(yǎng)3d后，直接涂片及離心沉渣涂片觀察細(xì)菌形態(tài)。④將置于保存液（含10%蔗糖和50%小牛血清)中，-70°C保存30d后的Gh菌，接種于含10%脫纖維綿羊血的布氏瓊脂平板中，37°C培養(yǎng)3d后，觀察菌落生長(zhǎng)情況、涂片觀察細(xì)菌形態(tài)、測(cè)定其尿素酶、氧化酶和過氧化氫酶活性，并繼續(xù)傳代觀察其形態(tài)變化。
2 結(jié)果
胃粘膜組織尿素酶試驗(yàn)4h及24h均為陰性。細(xì)菌初代培養(yǎng)物涂片發(fā)現(xiàn)含有Gh和Hp兩種菌。經(jīng)單菌落分離分別得到Gh和Hp菌的純培養(yǎng)，其中分離到的Gh菌株命名為Gh32。對(duì)Gh32的測(cè)定發(fā)現(xiàn)其氧化酶與過氧化氫酶均為陽性。并含有很強(qiáng)的尿素酶活性。Gh32在含有6%脫纖維綿羊血的布氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較差，菌落呈針尖狀。光鏡下可見細(xì)菌呈球形、腎形及短螺旋形，多數(shù)菌僅一個(gè)彎曲。在含10%脫纖維綿羊血的布氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，可長(zhǎng)成1mm～2mm直徑單個(gè)菌落，光鏡下可見細(xì)菌呈多螺旋狀，螺旋數(shù)目在1～6個(gè)之間，且螺旋較密。Gh32在蓋玻片下生長(zhǎng)不良；在滴加布氏湯和未滴加任何液體的對(duì)照部位，細(xì)菌菌落較小，呈針尖狀。在滴加新鮮血或凍融血而未被蓋玻片覆蓋處，菌落形態(tài)及光鏡下細(xì)菌形態(tài)與在含10%脫纖維綿羊血布氏瓊脂平板上生長(zhǎng)的情況相似。Gh32在液體培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)較慢，3d后液體僅輕度混濁，涂片發(fā)現(xiàn)細(xì)菌數(shù)目較少，但菌形良好，螺旋數(shù)在3～14個(gè)不等，長(zhǎng)度可達(dá)17μm左右。經(jīng)3，000r/min（臺(tái)式離心機(jī)上)離心3min后沉渣用少許生理鹽水懸浮涂片發(fā)現(xiàn)，多數(shù)細(xì)菌螺旋數(shù)在4～6個(gè)左右。將低溫保存Gh32初代復(fù)活時(shí)，菌落生長(zhǎng)良好。酶活性檢查發(fā)現(xiàn)，其尿素酶、氧化酶及過氧化氫酶均為陽性。涂片發(fā)現(xiàn)幾乎所有菌體均發(fā)生了球形變。連續(xù)傳代2次后，70%左右恢復(fù)典型形態(tài)，連續(xù)傳代3次后細(xì)菌幾乎全部恢復(fù)其典型形態(tài)。
3 討論
人們對(duì)胃螺旋菌的認(rèn)識(shí)已有一個(gè)較長(zhǎng)的歷史過程。早在1881年Rappin就報(bào)道在狗胃粘膜中觀察到螺旋形細(xì)菌的存在，此后又有許多在其它哺乳動(dòng)物胃粘膜中觀察到螺旋形細(xì)菌存在的報(bào)道。1906年Krienitz首先觀察到人胃粘膜中有3種不同類型的彎曲或螺旋細(xì)菌存在，但此后胃螺旋菌未能引起人們的足夠重視。隨著對(duì)幽門螺桿菌與胃炎及消化性潰瘍的關(guān)系的深入研究，人們開始重新對(duì)人胃螺旋菌進(jìn)行認(rèn)識(shí)。目前認(rèn)為此菌可能為除Hp外的又一類與胃炎有關(guān)的細(xì)菌。自1987年來世界各地已有近百例有關(guān)Gh感染的報(bào)道，國(guó)內(nèi)楊海濤等也曾報(bào)道14例Gh感染病人。人們自豬等動(dòng)物已成功地分離到了胃螺旋菌，近年來國(guó)內(nèi)外多位學(xué)者曾對(duì)Gh進(jìn)行分離培養(yǎng)，但至今未見有關(guān)Gh培養(yǎng)成功的報(bào)道，對(duì)Gh的研究也僅限于對(duì)病理組織學(xué)的觀察。我們自人胃粘膜組織中成功地分離到一株Gh，為對(duì)Gh的深入研究創(chuàng)造了必要條件。
雖然目前我們只分離到一株Gh菌，可能不能完全反映所有Gh菌所需要的培養(yǎng)條件，但我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到了Gh菌形態(tài)的易變性。在不同培養(yǎng)條件下，Gh可呈1～14個(gè)螺旋不等，甚至呈腎形或球形。Gh在培養(yǎng)條件不完全適合時(shí)，不能表現(xiàn)出其典型形態(tài)，而胃粘膜標(biāo)本中往往有多種細(xì)菌存在，在選擇性培養(yǎng)基上也可能不止有一種細(xì)菌生長(zhǎng)，對(duì)形態(tài)不典型的Gh菌，很容易被當(dāng)成雜菌或Hp菌處理。我們?cè)诜蛛x豬胃螺旋菌(Gastrospirillumsuis)時(shí)也曾發(fā)生類似情況，一度將一株豬胃螺旋菌作為幽門螺桿菌樣細(xì)菌（Helicobacter pylori like organism,hpLO)處理過，后來在半固體及液體培養(yǎng)時(shí)才觀察到其典型形態(tài)。Gh在人群中的感染率相對(duì)較低（僅1%左右)，更增加了Gh分離培養(yǎng)成功的難度。我們認(rèn)為以上因素可能是造成以往分離培養(yǎng)Gh失敗的主要原因。這提示人們，在作Gh分離培養(yǎng)時(shí)，如觀察到可疑Gh菌存在時(shí)，應(yīng)增加培養(yǎng)基中含血量或進(jìn)行液體培養(yǎng)，以便使Gh表現(xiàn)出其典型形態(tài)。由于Gh在固體培養(yǎng)基中菌形較短，而在液體培養(yǎng)時(shí)，雖菌形良好，但菌量較少，有關(guān)Gh的最適培養(yǎng)條件問題，仍需進(jìn)一步探討。
實(shí)驗(yàn)表明，Gh為微需氧菌，氧化酶和過氧化酶均為陽性，且有很高活性的尿素酶，而在胃粘膜組織直接尿素酶活性檢測(cè)時(shí)則為陰性，這可能與胃粘膜中Gh菌量較少有關(guān)。提示胃粘膜組織尿素酶陰性的依據(jù)，也不能反映Gh產(chǎn)生尿素酶活性的強(qiáng)弱。
實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)本病人胃粘膜中有Gh與Hp混合感染，兩菌同時(shí)感染的機(jī)會(huì)較少，目前僅有數(shù)例報(bào)道。病人經(jīng)組織學(xué)證實(shí)胃粘膜呈中度慢性淺表性胃炎伴中度活動(dòng)性胃炎表現(xiàn)。Gh在胃炎發(fā)生過程中所起的作用如何，有待進(jìn)一步研究。Gh的傳染和傳播途徑問題、Gh與豬、狗、貓胃螺旋菌間的關(guān)系，以及在胃內(nèi)這一特定微生態(tài)環(huán)境中Gh與Hp的關(guān)系等均有待于進(jìn)一步探討。Gh的培養(yǎng)成功，使對(duì)這一系列問題的研究成為可能。
張建中1 陳晶晶1 蔣秀高1 梁丕霞2
1中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病微生物學(xué)研究所（北京 102206)
2首都醫(yī)學(xué)院附屬天壇醫(yī)院（北京 100050)
